Vi presenterar en modell av ligamentvävnad, i vilken tredimensionella konstruktioner behandlas med det humana träningskonditionerade serumet och analyseras för kollagenhalt, funktion och cellulär biokemi.
In vitro- experiment är väsentliga för att förstå biologiska mekanismer; Klyftan mellan monolagsvävnadskultur och humanfysiologi är emellertid stor, och översättningen av fynd är ofta dålig. Således finns det gott om möjlighet till alternativa experimentella tillvägagångssätt. Här presenterar vi ett tillvägagångssätt i vilket humana celler isoleras från mänskliga främre korsbindiga vävnadsrester, expanderade i kultur och användes för att bilda manipulerade ledband. Övning förändrar den biokemiska miljön i blodet så att funktionen hos många vävnader, organ och kroppsliga processer förbättras. I detta experiment kompletterades ligamentkonstruktionskulturmedia med experimentellt humant serum som har "konditionerats" genom träning. Sålunda är ingreppet mer biologiskt relevant, eftersom en experimentell vävnad utsätts för den fullständiga endogena biokemiska miljön, innefattande bindande proteiner och tillsatsföreningar som kan förändras i takt med aktiviteten hos enOkänd agent av intresse. Efter behandling kan manipulerade ledband analyseras för mekanisk funktion, kollagenhalt, morfologi och cellulär biokemi. Sammantaget finns det fyra stora fördelar gentemot traditionell monolagskultur och djurmodeller, av den fysiologiska modellen av ligamentvävnad som presenteras här. För det första är ligamentkonstruktioner tredimensionella, vilket gör det möjligt att kvantifiera mekaniska egenskaper ( dvs. funktion) såsom ultimat dragspänning, maximal dragbelastning och modul. För det andra kan ingreppet, gränssnittet mellan bont och senelement, undersökas i detalj och inom funktionellt sammanhang. För det tredje möjliggör man att undersöka på ett opartiskt sätt förberedelserna av medier med efter-träningsserum, vilket gör att effekterna av den träningsinducerade biokemiska miljön, som är ansvarig för det stora utbudet av hälsoeffekter av motion, kan undersökas. Slutligen utvecklar den experimentella modellen vetenskaplig forskning på ett humant och etiskt sätt genom att ersätta användningen avDjur, ett kärnmandat för National Institutes of Health, Center for Disease Control och Food and Drug Administration.
Tendon och ligamentskador är vanliga och kan ha försvagande konsekvenser för normal rörlighet och livskvalitet. Kirurgisk ingrepp är ofta nödvändig men kan ha begränsad och varierad framgång 4 , 5 . Den nuvarande förståelsen av hur senor och ledband utvecklas, mognar och svarar på skador är ofullständiga och därmed behövs effektiva forskningsmodeller för att ge insikt i utvecklingen av effektivare behandlingar 5 . För att ta itu med denna kunskapsskillnad kan djurmodeller användas men in vivo- studier är i sig komplexa med svårigheter att styra miljön och direkt rikta in åtgärder mot den avsedda vävnaden. I motsats härtill kan den experimentella miljön lätt kontrolleras och övervakas in vitro med traditionell monolagscellkultur. Denna teknik kan emellertid överskrida den kemiska och mekaniska miljön och kan således inte återförasSena in vivo beteendet hos cellerna. Vävnadsteknik kan gifta sig med fördelarna med den komplexa in vivo- miljön i djurmodeller med kontrollen av in vitro- miljön och ger ett ytterligare verktyg för att studera fysiologi. Dessutom beväpnad med en bättre förståelse av ligamentutveckling kan vävnadsteknik också ge en källa till ympvävnad när kirurgisk rekonstruktion krävs 6 . Således validerar metoden som beskrivs häri en in vitro 3D-konstruerad vävnad som kan användas för att studera ligamentfunktion och morfologi.
Fibrinbaserade senor eller ligamentkonstruktioner har använts som en in vitro- modell för att studera fysiologiska processer innefattande kollagenfibrillogenes 7 och senutveckling 8 såväl som translationella tillämpningar, i vilka deras användbarhet som ympvävnad har utvärderats i en fårmodell av främre cruCiate ligament (ACL) rekonstruktion 9 . Vårt laboratorium har tidigare etablerat en 3D-konstruerad ligamentmodell som spänner över två pensit, ett kalciumfosfatben-substituerande material, cementankare. Denna modell kan enkelt underkastas olika experimentella förhållanden genom att komplettera kulturmediet med biologiska faktorer 10 eller tillämpa mekanisk stimulering 11 . Viktigt är att denna ben-till-ben-ligamentmodell möjliggör en djup analys av entesen, gränssnittet mellan bont och senelement, vilket är mottagligt för skada.
I studien framhävd 1 för att presentera denna metodik var vi intresserade av effekten av träningsinducerade förändringar i den biokemiska miljön på ligamentfunktionen. Övning förbättrar cell- och organfunktionen i en mängd olika vävnader genom kroppen 2 , 3 , </suP> 12 , en effekt som kan hänföras till frisättningen av olika kända (t.ex. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-liknande 15 , exosomer 16 , 17 ) och andra okända, biokemiska faktorer frisläppta i systemcirkulationen . Vidare berikas den biokemiska miljön efter träning med träningsreaktiva hormoner, vars frisättning stimuleras genom stimulering av sekretoriska körtlar i sympatiskt nervsystem ( t.ex. kortisol och katekolaminer från binjuren 18 och tillväxthormon från den främre hypofysen 19 ). Men jag är n vivo , det är omöjligt att skilja effekterna av den mekaniska stimulansen av motion från träningsinducerade biokemiska förändringar. Medan vissa studier har karakteriserat den förväntade ökningen av vissa cirkulerande hormoner och cytokiner som svar på exercisE som nämnts ovan finns det för många faktorer, både kända och okända, att troligt rekapitulera in vitro. Det vill säga att isolera några faktorer för en in vitro- studie behandlar otillräckligt komplexiteten hos det biokemiska svaret. I den här undersökningen undersökte vi hur förändringar i den biokemiska biologiska miljön, som orsakas av träning, påverkar funktionell ligamentfunktion. För att isolera effekterna av de biokemiska förändringarna erhöll vi serum från humana deltagare före och efter en kamp mot motståndsövning och använde den för att behandla 3D-konstruerade ligament som bildades med hjälp av mänskliga främre korsband (ACL) fibroblaster. Med hjälp av denna modell kan vi få funktionella data, inklusive effekter på mekaniska egenskaper och kollageninnehåll, samt kvantifiera effekter på molekylär signalering.
Det nuvarande manuskriptet beskriver en modell av ligamentvävnad som är en användbar experimentell plattform för utredare med ett brett spektrum av forskningsämnen, från vävnadsutveckling till translationella / kliniska frågor. Den konstruerade ligamentmodellen som beskrivs här baseras på ett mångsidigt protokoll som kan anpassas på olika punkter genom arbetsflödet ( Figur 1 och Diskussionsavsnittet ). Vidare kan den naturligt reduktiva naturen hos in vitro- miljön bringas närmare det fysiologiska området genom att komplettera matningsmedier med konditionerat humant eller djurserum.
Konstruktioner kan bildas med användning av fibroblaster från en mängd olika källor
Medan de metodologiska och representativa resultaten som visas här är baserade på användningen av primära ACL-fibroblaster kan cellisoleringsprotokollet justeras för att samla andra typer av primära fibroblaster. Som beskrivenI figur 4 visar konstruerade ligament bildade med primära celler isolerade från unga humana donatorer låg donatorvariabilitet. Primärceller begränsas av initial isolering och passagebegränsning; Användningen av cellinjer kan förbättra reproducerbarheten av experimenten. Användningen av andra celltyper kan kräva modifieringar i cellodlingsmedia och fibrin-gelformulering. Till exempel har vi observerat att mänskliga mesenkymala stamceller (MSCs) inte kan bilda linjära vävnader mellan borstitcementankrarna under 2 veckor medan hästens överlägsna digitala flexor-tendonfibroblaster, hästbenmärgsstromala celler, embryonala tendonfibroblaster , Och murina C3H10T1 / 2 MSCs kontraherar snabbt och smälter fibringelen för att bilda en linjär vävnad (obublicerade observationer). Denna kontrast kan vara en följd av skillnader i cellkontraktilitet, proliferation och fibrinolytisk enzymproduktion.
Användning av kemikalierOch mekanisk stimulering
I det här beskrivna förfarandet bildar fibrinbaserad vävnad kring borstitcementankar, vilket möjliggör applicering av mekanisk stimulering via en sträckbioreaktor 11 såväl som för slutpunktstestningstestning. Närvaron av borsteitcement-mjukvävnadsgränssnittet (enthesis) ger också möjlighet till ytterligare undersökning och förbättring 22 , 26 (se avsnittet Kliniska tillämpningar nedan). I denna in vitro- miljö kan bidraget från kemiska och mekaniska faktorer lättare identifieras; Ett exempel på detta visas i figur 5 , varigenom effekten av serummiljön efter träningen separerades från den mekaniska stimulansen för motion. Pilotstudier kan behövas för att bestämma tidsramen för försöksinterventioner, sammansättning av behandlingar och lämpliga slutpunkter för att förvänta sig en observerbar förändring. FoExempelvis, i efterstudie-serumstudien 1 , begränsades längden av experimentell behandling av tillförseln av serum som användes för att komplettera media, varifrån konstruktionerna matades varannan dag. Under den andra veckan av odling kompletterades odlingsmediet med resten eller efter-övningsserum med askorbinsyra och L-prolin bibehölls medan TGF-β1 avlägsnades. TGF-β1 är en känd profibrotisk tillväxtfaktor som ökar i serum efter övning 27 . För att undvika att dämpa TGF-β1-relaterade effekter av efter-övningsserumet behölls detta cytokin inte i odlingsmediet.
Denna konstruerade ligamentmodell kan också användas för att testa effekten av mekanisk sträckning. Genom att konstruera omvänd modellerade grepp för att hålla borstettcementankarändarna (liknar den enhälliga dragprovningen som visas i Figur 1 ) kan sträckbioreaktorer konstrueras för att rymma eng Ineered ligament. Vårt laboratorium har tidigare använt denna modell för att undersöka det molekylära signaleringssvaret hos manipulerade ligament till enaxlig dragsträcka i en skräddarsydd bioreaktor 11 som kommer att ge en bättre förståelse för den rationella utformningen av ett in vitro sträckparadigm eller till och med potentiellt in vivo Stretch / aktivitet / terapeutiska applikationer.
Bedömning av manipulerade ledband
Som med traditionell monolagskultur kan 3D-konstruktioner analyseras för gen / proteinuttryck; Dessutom ger deras 3D-morfologi möjlighet att bedöma funktionella och morfologiska förändringar och konstruktioner kan bibehållas i kultur för långsiktiga studier ( Figur 3 ). Medan manipulerade ligament inte är ekvivalenta med naturliga, mogna ligament, har de likhet med att utveckla senor / ligament och uppför sig på liknande sätt som nativa vävnader som svar på näringsämnen"> 26, tillväxtfaktorer 10 , hormoner 25 och övning 11 , 28. Sålunda är försiktighet innan man gör breda generaliseringar från vilken in vitro- modell som helst, kan resultaten från ligamentkonstruktionstest avslöja eller informera en viss fysiologisk mekanism som annars kan vara Omöjligt att undersöka in vivo.
Komplettera matningsmedier med konditionerat serum för en flexibel och dynamisk modell med breda applikationer
Det humana serummetabolomen är en miljö av ~ 4500 föreningar inkluderande, men inte begränsat till, glykoproteiner, lipoproteiner, lipidderivat, energisubstrat, metaboliter, vitaminer, enzymer, hormoner, neurotransmittorer och en mängd byggstenar / intermediärer. 29 Ytterligare kontroll av den humana serummetabolomen enligt föreningsklasserna 29 avslöjar additiOnal fördelar med att integrera experimentellt serum i in vitro-experiment. Det vill säga majoriteten av de ~ 4500 föreningarna i serum är hydrofoba eller lipid-härledda, vilket understryker vikten av bindande proteiner för transport / solubilisering. Det följer att experimentell rekapitulering av endogena föreningstransportdynamik, och därmed biotillgänglighet och sammansatta mål-interaktioner, skulle vara nästan omöjligt. Sålunda är experimentellt serum särskilt effektivt för studier av föreningar som är kända för att bero på tillsatsmolekyler för solubilisering, transport, målbindning och verkningsmekanism.
Vårt laboratorium har ett långvarigt intresse för hälsoeffekterna av motion. Övning förbättrar cellulär och organfunktion i en mängd olika vävnader genom kroppen 12 , en effekt som kan hänföras till en mängd olika faktorer (t.ex. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-liknande 15 ,Exosomer 16 , 17 ) som frisätts i systemisk cirkulation. Den biokemiska miljön efter träningen reflekterar faktorer som frigörs både från kontrakterande skelettmuskulatur-reaktionshämmande hormoner samt faktorer som frigörs som resultat av sympatiskt nervsystemstimulering av sekretoriska körtlar ( t.ex. kortisol och katekolaminer från binjuren 18 och tillväxt Hormon från den främre hypofysen 19 ). Vi har nyligen använt en modell av före- och efterövande serum för att undersöka effekterna av den träningsinducerade biokemiska miljön på manipulerad vävnad. 1 Medan många viktiga träningsrelaterade forskningsfrågor kvarstår är modellen på ingen sätt begränsad på detta sätt. Exempelvis kan serum erhållas, antingen från djur eller mänskliga källor, efter diet eller farmakologiska ingrepp eller från olika åldersgrupper eller klinisk populationS 30 . På detta sätt kommer exogena eller endogena föreningar av intresse att finnas närvarande i serum och behandlingsmedia i biotillgängliga kvantiteter och kommer att interagera med målvävnaden i samverkan med den endogena miljön ( dvs. i ett mer fysiologiskt sammanhang). Detta tillvägagångssätt är dynamiskt eftersom det är högst sannolikt att en given intervention kommer att utöva en multi-organ (och multi-compound) effekt och således kommer den fysiologiska miljön att modifieras. Medan detta tillvägagångssätt presenterar vissa utmaningar, eftersom flera systemiska biokemiska variabler ändras samtidigt, är det ett tillvägagångssätt som kan bidra till att övervinna nackdelarna med rent reduktivistisk experimentell metodik 31 , 32 . Tillsammans kan implementering av konditionerat serum tillsammans med en vävnadsteknisk ( in vitro biomimetisk ) vävnad användas som ett verktyg för fysiologi, näring och kliniska forskningsfrågor.
<stronG> Kliniska tillämpningar är många
Den vävnadsteknikmodell som presenteras här kan användas för att undersöka anatomiska och kliniska forskningsfrågor som traditionella in vitro- modeller inte kan. En ligament eller sena in vivo innehåller en mjuk-till-hård vävnadsövergångsområde som kallas enthesisen. Induktionen, som är sårbar mot mekanisk stressrelaterad skada 33 , kan studeras i tvärsnitt via histokemiska och elektronmikroskopitekniker 22 , 26 . Detta unika gränssnitt är dubbelt viktigt för dem med låg eller begränsad rörlighet, eftersom fysisk inaktivitet försvårar bindvävens förmåga att överföra belastning till regioner med låg till hög överensstämmelse 34 , vilket resulterar i en övergripande minskning av vävnadsöverensstämmelse och ökad skaderisk.
Vårt lab har nyligen använt denna vävnadstekniska modell 25 </ Sup> att modellera en annan befolkning, kvinnliga idrottare, som riskerar för biverkningar i bindväv: incidensen av ACL-skada är ungefär fem gånger större än deras manliga motsvarigheter 35 . Potentiella mekanismer som ligger till grund för denna könsbaserade skillnad i skada undersöktes genom behandling av ligamentkonstruktioner med fysiologiska koncentrationer av det kvinnliga könshormonet östrogen i koncentrationer som efterliknade stadier av menstruationscykeln. Intressant hämmade höga koncentrationer av östrogen genuttrycket och aktiviteten hos lvs-oxidas, det primära enzymet som är ansvarigt för att skapa lysin-lysin-tvärbindningar i kollagenmatrisen av ligament och senor. Viktigt är att 48 h hög östrogen (för att simulera follikulärfasen) minskade ligamentkonstruktiv styvhet utan att ändra konstruktionens kollagendensitet. Ur ett fysiologiskt perspektiv tyder detta på att ökningen av ligamentslakhet hos kvinnor kan bero på att åtminstone delvisTvärbindningsbildning. Ur ett experimentellt perspektiv markerar dessa fynd 25 nyttan av 3D-konstruktmodellen, vilket medger att funktionell tvärbindningsaktivitet kan undersökas. Ur ett kliniskt perspektiv kan denna modell nu användas för att snabbt skärpa efter ingrepp som kan förhindra de negativa effekterna av östrogen av ligamentfunktionen.
Avslutande kommentarer
Här har vi presenterat en detaljerad metod för bildandet av manipulerade ledband och deras användbarhet som en 3D- in vitro- vävnadsmodell. Modellen är mycket anpassningsbar till ett brett spektrum av mål, vilket ger flexibilitet i celltyp, interventioner och resultatåtgärder av intresse. Tillägg av matningsmedier med konditionerat serum lägger till ett fysiologiskt sammanhang som inte kan uppnås i en traditionell in vitro- miljö, vilket förbättrar modelleringen av in vivo- fysiologi. Kortfattat anser vi att detta är ett brett tillämpligt lägeL med spännande konsekvenser för att främja både fysiologiska och vävnadstekniska områden.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett NSERC-postdoktoralt stipendium (DWDW), ett ARCS Foundation Scholarship (AL) och en UC Davis College of Biological Sciences-bidrag (KB).
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 | Entomoravia | N/A | For brushite cement anchors; include info on multiple sources and alternative products |
β-tricalcium phosphate | Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) | N/A | For brushite cement anchors; include whether it's hazardous /toxic |
o-phosphoric acid, 85% (w/w) | EMD Millipore | PX0995 | For brushite cement anchors; include info on preparation |
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500g | For brushite cement anchors |
Falcon 35mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | For silicone-coated plates |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | For silicone-coated plates |
1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | SH3002802 | For cell isolation and expansion |
100X antibiotic/antimycotic solution | VWR | 45000-616 | For cell isolation |
Type II collagenase | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | For cell isolation |
100X penicillin/streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For cell isolation |
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated | EMD Millipore | SCGP00525 | For reagent sterilization |
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine | VWR | 10-013-CV | For cell and tissue culture |
Fetal bovine serum | BioSera | FBS2000 | Component of tissue digestion media and growth media |
Penicillin G Potassium Salt | MP Biomedicals | 0219453680 – 100 MU | Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C. |
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 x 20 mm) | VWR | 82050-598 | For cell culture |
Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | For cell isolation |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | For cell freezing media |
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | For cell freezing |
BD Vacutainer Red Plastic 10 ml | Fisher Scientific | 367820 | For human serum collection |
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22ga x 1inch Needle | Fisher Scientific | 354221 | For human serum collection |
Thrombin, bovine origin | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
Fibrinogen, bovine origin | Sigma-Aldrich | F8630-5G | For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A3428 | For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
6-Aminohexanoic acid | Sigma-Aldrich | 07260-100g | For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4°C. |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
L-proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
Transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20°C. |
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized | EMD Millipore | SCGPU02RE | For reagent sterilization |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | Dilute in water to 6M |
4-Dimethylaminobenzaldehyde | Sigma-Aldrich | 39070-50g | For hydroxyproline assay |
Chloramine-T trihydrate | Sigma-Aldrich | 402869-100g | For hydroxyproline assay |
trans-4-Hydroxy-L-proline | Sigma-Aldrich | H54409-100g | For hydroxyproline assay |
1-propanol | Sigma-Aldrich | 279544-1L | For hydroxyproline assay |
Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421-250ml | For hydroxyproline assay |
Acetic acid, glacial | EMD Millipore | AX0073-9 | For hydroxyproline assay |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | For hydroxyproline assay |
Toluene, anhydrous | Sigma-Aldrich | 244511-1L | For hydroxyproline assay |
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-656 | For hydroxyproline assay |