Her beskriver vi en fremgangsmåde til isolering af celler i bugspytkirtlen mikromiljø fra embryonale, neonatale og voksne mus væv, der fokuserer på isolering af mesenchymale celler. Denne fremgangsmåde tillader profilering af celle genekspression og proteinsekretion for at belyse de ydre signaler, som regulerer bugspytkirtel udvikling, funktion og tumorigenese.
The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.
Energi-homeostase og fordøjelse hos pattedyr afhænger af korrekt pancreasfunktionen. Den voksne pancreas består af to vigtigste cellulære rum: det exokrine og endokrine. Eksokrine celler, herunder de acinære celler, der producerer og udskiller fordøjelsesenzymer og kanal- celler, der transporterer disse enzymer til tarmen, omfatte mere end 80% af den totale pancreas- masse 1. Endokrine celler, som omfatter insulinproducerende betaceller og glucagon-producerende alfa-celler, er organiseret i de Langerhanske øer, der er indlejret i exokrine væv og udskiller hormoner til at regulere blodsukkerniveauet 2.
Pancreasceller erhverve deres differentierede skæbne gennem en meget reguleret, flertrins proces 3. Undersøgelser viser, at ydre signaler leveret af neuronal, endotel- og mesenkymceller guide pankreatisk celledifferentiering og proliferation i than embryo 3, 4, 5. Et eksempel er kravet af aorta for specifikation af tidlige pancreas forstadier 6. Senere i udvikling, blev endotelceller vist at spille en central rolle i udviklingen af både pancreas endokrine og eksokrine celler og fremme beta-celledifferentiering 4, 6, 7. Mesenchymceller viste sig at understøtte overlevelse og ekspansion af fælles pancreas progenitorer, hovedsagelig gennem sekretion af vækstfaktoren Fgf10 8, 9. Vi har yderligere vist, at disse celler understøtter proliferation af endokrine og exokrine prækursorer, samt af differentierede celler (herunder acinære og beta-celler) i den embryoniske pancreas 5. For nylig, mesenkymale celler blev yderligerevist at regulere endokrine celler differentiering 10.
I den voksne, blev beta-cellefunktion og masse vist sig at afhænge af celler i deres mikromiljø, herunder neuronal, immun, og endotelceller samt pericytes 11, 12, 13. Under skade blev endotelceller vist at rekruttere immunceller til bugspytkirtlen til at fremme beta-cellereplikation 13. Endotelceller blev yderligere vist sig at producere ekstracellulær matrix (ECM) komponenter til støtte insulinekspression og beta-cellefunktion 14. Vi har for nylig demonstreret kravet af ø pericytter for beta-cellefunktion 11. Endelig blev cellerne i pancreas stroma vist at regulere udviklingen af pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) 15, 16. Imidlertid idenhed af ydre signaler, der styrer bugspytkirtlen udvikling, funktion og tumorigenese er stort set ukendt.
Identificering tidskoder leveret af celler i bugspytkirtlen mikromiljø kræver karakterisering af gener og proteiner udtrykt af disse celler. Dette afhænger af at isolere disse celler fra bugspytkirtlen for at udføre genekspression og proteomikanalyser og / eller på at etablere cellelinier. Her foreslår vi en fremgangsmåde til isolering af mesenchymale celler i bugspytkirtlen mikromiljø ved anvendelse af væv enzymatisk fordøjelse og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) af enten immunofluorescently-mærkede celler eller celler, der udtrykker fluorescerende proteiner. Denne protokol blev succesfuldt udført for at isolere og analysere gult fluorescerende protein (YFP) udtrykkende mesenkymale celler i embryonale, neonatal, og voksen pancreas 5, 17.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til at isolere og analysere celler i pancreas mikromiljø. Denne metode kan anvendes til at isolere mesenchymal-celler fra embryonale og voksen pancreasvæv. Desuden har vi med succes brugt denne protokol til at isolere endothelceller fra den voksne og neonatal bugspytkirtel 5, 17. Det kan dog ikke være egnet til at opnå en reproducerbar enkelt-cellesuspension af pancreasepitelceller (alternative protokoller er beskrevet i referencer 18, 23, og 24). Under anvendelse af denne metode, fluorescens-mærkede celler, der enten udtrykker fluorescerende proteiner eller immunfarvet for overflademarkører, kan oprenses ved FACS eller analyseres ved flowcytometri. RNA kan ekstraheres fra oprensede celler at profilere deres genekspression mønster. Alternativt kan oprensede celler dyrkes for at etablere en cellelinje til efterfølgende proteomanalyse. Denne metode vil muliggøre karakterisering af faktorer expressed af bugspytkirtlen mikromiljø, der regulerer dens organogenese, fysiologi og patofysiologi.
Den bugspytkirtlen mesenkym understøtter væv organogenese ved at fremme udbredelsen af prækursorer og differentierede celler 5, 9. Disse celler viste sig at støtte udvidelsen af humane embryonale stamceller (embryonale) afledte pancreas stamfædre 17, 25, 26. Derfor afgrænser identiteten af embryonale mesenkymale faktorer vil lette igangværende bestræbelser på at generere insulinproducerende betaceller fra hESCs og inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) som en potentiel kur til diabetes. Mus genetiske undersøgelser tillod identifikation af vækstfaktorer, såsom Fgf10, der er produceret af mesenchymet at fremme bugspytkirtlen epitel ekspansion i de tidlige stadier af bugspytkirtlen udvikling3, 9. Med henblik på at identificere yderligere faktorer udtrykt i embryonale mesenkym, vi isolerede disse celler ved hjælp af laser-fanget mikrodissektion, udvundet deres RNA, og udførte genekspression analyse 26. Men ud over at være arbejdskrævende intens, denne metode beror på at identificere celler baseret på deres morfologiske træk, som begrænser brugen til udviklingsstadier før forgreningen af epitelet i den omgivende mesenkym (dvs. E12.5). For at karakterisere mesenchymale celler på senere udviklingsstadier, anvendte vi den her beskrevne fremgangsmåde 5, 17.
Vi brugte denne metode til at analysere overfladen markør udtryk ved neonatal bugspytkirtlen mesenkym 5. Desuden blev mesenchymal-celler isoleret fra embryonale og neonatal pancreasvæv af Nkx3.2 -Cre; R26-EYFP mus, baseret påderes fluorescerende mærkning i denne mus linie, og blev dyrket til at etablere cellelinier 17. Den proteomisk analyse af disse celler er tilladt for identifikation af faktorer, der udskilles af pancreas mesenkym med evnen til at fremme hESC-afledte pancreas progenitorer 17. Vi anvendte yderligere denne celle isolation metode til at oprense mesenchymal-celler fra voksne pancreas væv til RNA-ekstraktion og genekspression analyse 17. Derfor kan denne metode anvendes til at identificere gener og proteiner udtrykt af den pankreatiske mesenkym, med evnen til at understøtte pancreas celleudvikling.
Pankreatiske mesenkymale celler blev yderligere vist at spille en rolle i pancreas tumorigenese. PDAC er karakteriseret ved dannelsen af en fibroblast-rige desmoplastiske stroma består af fibroblaster, immunceller, og ECM 27. Mens stroma blev anset for at fremme udviklingen af mangetyper af kræft, blev det vist at begrænse PDAC progression 15, 16, 28. Dette antyder, at komponenter af pancreas stroma secernerer faktorer, der hæmmer tumorigenese. Endvidere kan ændringer i stroma cellulære sammensætning samt i cellefænotype ligge til grund for deres virkning på epitelceller 15, 16, 28. Den her beskrevne metode kan derfor bidrage til at karakterisere de forskellige celletyper, der udgør en PDAC stroma sammenlignet med raske pancreasvæv. Det ville endvidere tillade oprensning af de forskellige stromale celletyper at karakterisere potentielle ændringer i deres genekspressionsprofiler under PDAC progression. Men på grund af ændringer i pancreas ECM sammensætning under tumorigenese 27, justeringer af vævsfordøjelse parametre, såsom optagelse af additional collagenase typer eller forøge inkubationstiden, kan være påkrævet.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.
Collagenase P | Roche | 11213865001 | |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein |
Hanks’ Balanced Salt solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | H6648 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | 04-127-1A | |
EDTA | Biological Industries | 01-862-1A | |
Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Goat IgG serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
RNAse inhibitor | Invitrogen | N8080119 | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965092 | |
L-Glutamine | Biological Industries | 03-020-1B | |
Penicillin-streptomycin | Biological Industries | 03-031-1B | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride |
1.5 ml tubes | Sarstedt | 72 690 | |
15 ml conical tube | Corning | 430052 | |
Round Bottom Polystyrene 5 ml tube | Corning | 352008 | FACS tube'. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands |
5ml tube with 35 μm cell strainer Snap Cap | Corning | 352235 | FACS tube' |
70 μm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
Heating block with agitation | Eppendorf | ThermoMixer C | |
Centrifuge | ThermoFisher | Heraeus Megafuge 40R | |
Steromicroscope | Nikon | SMZ 745 | |
Cell sorter | BD Biosciences | FACSAria IIu | |
flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios |