En este trabajo se describe un modelo experimental de la hemostasia que mide simultáneamente la función plaquetaria y la coagulación. Plaquetas y fibrina de fluorescencia se mide en tiempo real, y la tasa de adhesión plaquetaria, la tasa de coagulación, y el inicio de la coagulación se determinan. El modelo se utiliza para determinar las propiedades procoagulantes de plaquetas bajo flujo en concentrados para la transfusión.
modelos de microfluidos de la hemostasia evaluar la función plaquetaria en condiciones de cizallamiento hidrodinámico, pero en presencia de anticoagulantes, este análisis se limita únicamente a la deposición de plaquetas. La intrincada relación entre Ca 2+ función de coagulación y plaquetas dependiente requiere recalcificación cuidadosa y controlada de sangre antes del análisis. Nuestra configuración utiliza un canal de mezcla en forma de Y, que suministra el concentrado de tampón de Ca2 + / Mg2 + a fluir la sangre justo antes de la perfusión, lo que permite una rápida y sin recalcificación estasis muestra. A diferencia de diez veces en la velocidad de flujo entre ambos depósitos minimiza la dilución. La sangre recalcified se perfunde entonces en una cámara de análisis recubierta con colágeno, y el etiquetado diferencial permite imágenes en tiempo real tanto de plaquetas y deposición de fibrina mediante microscopía de fluorescencia de vídeo. El sistema utiliza sólo herramientas disponibles en el mercado, lo que aumenta las posibilidades de normalización. La reconstitución de excelentes referenciasmbocytopenic sangre con plaquetas de peraltada concentra, además, modelos de transfusión de plaquetas, lo que demuestra su uso en este campo de investigación. Ejemplos de datos demostraron que el inicio de la coagulación y deposición de fibrina eran linealmente dependiente de la concentración de plaquetas, lo que confirma la relación entre la hemostasia primaria y secundaria en nuestro modelo. En un plazo de 16 minutos de perfusión, la activación por contacto no tuvo lugar, a pesar de recalcificación de Ca 2+ normales y los niveles de Mg 2+. Cuando el factor de coagulación XIIa fue inhibida por el inhibidor de tripsina de maíz, este marco de tiempo era incluso más tiempo, lo que indica un rango dinámico considerable en la que los cambios en la naturaleza procoagulante de las plaquetas se puede evaluar. Co-inmovilización de factor tisular con el colágeno redujo significativamente el tiempo hasta la aparición de la coagulación, pero no su tasa. La opción para estudiar el factor tisular y / o la vía de contacto aumenta la versatilidad y la utilidad del ensayo.
hemostasia primaria y secundaria se conceptualiza originalmente como dos procesos bioquímicos relativamente separables. hemostasis primaria fue visto como un contribuyente importante en condiciones de flujo arterial, con un papel clave para las plaquetas, mientras que la hemostasia secundaria fue visto a dominar la coagulación bajo flujo de sangre venosa, lo que permite la cascada de proteasas para formar fibrina insoluble. Las últimas décadas han modificado sustancialmente esta visión tradicional, reconociendo que la activación plaquetaria y la coagulación son interdependientes y son igualmente importantes procesos durante la hemostasia fisiológica y patológica en todos (no extremas) ambientes hidrodinámicas. Esta opinión ha sido traducida a la clínica, donde cada vez se utilizan ensayos ideados para medir integralmente la coagulación de sangre completa, aunque con muchas cuestiones pendientes sobre la pertinencia, aplicabilidad y utilidad 1.
Recientemente hemos publicado un análisis funcional de las plaquetasconcentrados utilizando cámaras de flujo de microfluidos recubiertas con colágeno fibrilar en un modelo in vitro de la transfusión de 2, con muestras que contienen cantidades normales de glóbulos rojos, plasma y plaquetas. Este método utiliza heparina o hirudina sangre anticoagulada, lo que implica o ninguna participación limitada de hemostasis secundaria, que es dependiente de la generación de trombina y calcio ionizado (Ca 2+). Para apoyar la formación de trombina y por lo tanto para incluir todos los aspectos de la hemostasia bajo flujo de microfluidos, hemos desarrollado un método complementario en la misma plataforma técnica, incluyendo ahora libre de Ca2 +. De esta manera, la deposición de plaquetas y la formación de fibrina se pueden estudiar, de nuevo en un modelo de la transfusión de plaquetas, para evaluar la calidad de concentrado de plaquetas.
En este método, las plaquetas y el fibrinógeno están etiquetados con fluoróforos que se han separado completamente espectros de emisión. color dual, microscopía de vídeo en tiempo real a continuación, permite el análisis deadhesión primaria de plaquetas, así como la iniciación de la coagulación y deposición de fibrina. Una variable importante en este tipo de ensayo es de recalcificación, porque la adición de Ca2 + a la sangre estática, antes de la perfusión, inevitablemente causar la coagulación de contactos iniciada en el recipiente. Esta iniciación se sesgo la lectura debido a la obstrucción de los tubos y de biochips entradas antes de la perfusión. Por lo tanto, en nuestro método, citrato de sangre anticoagulada y un tampón -Con Ca 2 + son bombeados por separado a través de las patas superiores de una cámara de entrada en forma de Y. Los componentes se mezclan durante la perfusión antes de entrar en una cámara de análisis recubiertas con colágeno solo o en combinación con el factor tisular humano recombinante (rhTF). Mediante la adaptación de las velocidades de flujo de las bombas separadas y la concentración de Ca2 + en la memoria intermedia, una dilución de 10% de la muestra de sangre final se lleva a cabo.
El uso de este protocolo extendido, se demuestra la contribución de coágulosfactor de la XII (FXII) y la concentración de plaquetas para contactar iniciación vía de coagulación bajo flujo. Nuestros datos también muestran que mediante el recubrimiento de rhTF junto a colágeno, la vía del factor tisular se puede medir de forma concomitante.
La transfusión de concentrados de plaquetas se le recetó al paciente trombocitopénica para prevenir o detener el sangrado. Su impacto clínico fue destacado recientemente en una revisión histórica de la leucemia aguda 12, recordando que el aumento de las tasas de supervivencia de los pacientes pediátricos en los años sesenta y setenta fueron en gran parte atribuible a las mejoras en (plaquetas) la medicina transfusional. Los concentrados de plaquetas también se utilizan para detener la hemorragia en trauma agudo o durante la cirugía. En estas condiciones, se prefieren las plaquetas con excelentes propiedades procoagulantes que inician rápidamente hemostasis, pero concentrados de plaquetas se preparan a partir de donaciones de donantes voluntarios y, a diferencia de la medicación farmacológica, están estandarizados por preparación solamente, no por la composición (química). Por lo tanto, varias cuestiones en el ámbito de los bancos de sangre están sin respuesta, incluidas las relativas a las modalidades óptimas de donación, condiciones de almacenamiento y las prácticas de transfusión. En el campo de la platelet (transfusión) biología, muchas preguntas sobre el aclaramiento de las células de la circulación, la contribución de las plaquetas transfundidas a la hemostasia, o la inmunología también siguen sin respuesta.
Numerosas técnicas de laboratorio para el análisis de la función plaquetaria están disponibles, pero éstos generalmente se refieren a un aspecto singular de la función plaquetaria, como agregación o desgranulación 13. Para evaluar ampliamente las plaquetas y concentrados de plaquetas, modelos integrales de la hemostasia son indispensables, y éstos deben incluir la hidrodinámica. Reología de la sangre es crucial para interpretar correctamente el comportamiento de las plaquetas durante la hemostasia 14, 15 o trombosis 16, incluso si la anticoagulación impide Ca2 + y / o trombina para participar en la presencia de citrato o heparina, respectivamente 2. Para estudiar la interacción entre la coagulación y la función de las plaquetas bajo un flujo de 17, Se requiere que 18, la generación de trombina normal y, por lo tanto, libre de Ca2 + también. La configuración experimental para el estudio de la hemostasia en estas condiciones es complejo, debido a las medidas para prevenir "artefacto" o la activación incontrolada de la coagulación se debe tomar tanto como sea posible. Por otra parte, muchos grupos de investigación especializados utilizan a medida de hardware 19, 20, lo que provoca una variabilidad sustancial entre laboratorios 5. Limitaciones típicas de este enfoque son el uso de recipientes rectangulares, perfiles de flujo no pulsátil, y recubrimientos de superficies no humanos 5. El ensayo se describe aquí utiliza las herramientas disponibles en el mercado y por lo tanto puede ser adecuado para la normalización.
Debido a que la reacción de coagulación en cascada se activa fácilmente una vez que la sangre no está contenida dentro del cuerpo humano, recalcificación controlada es un paso fundamental. To lograr esto, la adición de Ca 2+ necesita ser aplazado hasta justo antes de la perfusión sobre la superficie reactiva de colágeno, ya que cuando el Ca 2+ tampón se suministra a granel a la sangre estática, la coagulación se produce, inevitablemente, con el tiempo la obstrucción de la tubería y de desviación de datos interpretación (datos no mostrados). La solución a este problema es bombear el tampón de Ca2 + y la sangre por separado, lo que permite para la mezcla por las fuerzas convectivas y de difusión durante la perfusión en su camino hacia la cámara de análisis. La mezcla completa se logra en un segmento de 46 cm de tubo entre las cámaras de mezcla y de análisis. Esta longitud se ha calculado para el tiempo de permanencia óptimo de reactivos para mezclar acuerdo con las leyes fundamentales de la masa y el transporte convectivo 21 durante la perfusión con el caudal utilizado (1.000 s -1). Este enfoque resultó controlable y reproducible.
Contacto activación de la coagulación a veces se considera como un artefacto de sencilloel muestreo de sangre y que se debe evitar en la interpretación de los tiempos de coagulación. Por lo tanto, hemos demostrado que, en ausencia de inhibidores, la coagulación de contacto inducida comienza a 16,7 min (± 3,7 min) de la perfusión. En presencia de CTI para inhibir la activación de contacto mediada por FXIIa, coagulación no se inicia durante el curso definido arbitrariamente del experimento (30 min). Esta ventana de experimentación es suficientemente largo para discernir las muestras que son pro- o antitrombótico. A pesar de que la coagulación por activación de contacto puede ser una consecuencia no deseada de contacto con la sangre superficies artificiales, nuestros datos demuestran un efecto de la dosis biológica clara de plaquetas. Esto puede ser importante para la medicina de transfusión, debido a los recientes descubrimientos en factor XII, polifosfatos de plaquetas 10, 22 de distribución fosfatidilserina, y micropartículas de plaquetas 23 en realidad han revalorizado el contacto vía de coagulación como un importante contribuyente a la hemostasia, eespecialmente en el contexto de la trombosis 24. Por ejemplo, el rendimiento variable del transfusiones de plaquetas en pacientes o la expresión variable de fosfatidilserina de plaquetas en bancos pueden por lo tanto inducir la variabilidad en la eficacia terapéutica si se demuestra que la coagulación éxito dependiendo de estos factores.
Por co-inmovilización lipidada rhTF con el colágeno, la vía extrínseca de la coagulación, o vía del FT, se activa durante la deposición de plaquetas sobre colágeno. Esto extiende el ensayo a su modo más completo, como un modelo para las lesiones que llevan sangre en contacto con las células y tejidos que lleva por TF. Nuestros datos muestran que la co-inmovilización de colágeno y TF disminuye el momento de inicio de la coagulación, pero no altera la tasa de coagulación. Es de destacar que la cantidad de rhTF inmovilizado a la superficie es una variable importante en este modelo 25, 26 y debe ser estandarizado dentro de un estudio dado. En el presence de CTI, la vía de TF puede ser estudiado exclusivamente (no se muestra), ya que se impide la activación de contacto.
En conclusión, nuestra configuración experimental combina un modelo de la transfusión de sangre por la reconstitución de trombocitopénica con las plaquetas en bancos y un modelo de la hemostasia por deposición plaquetaria dependiente de calcio y la formación de fibrina en un flujo hidrodinámico. Este ensayo se utilizará para responder a las preguntas sobre la naturaleza procoagulante de las plaquetas en bancos y las técnicas de preparación de concentrado de plaquetas tienen efectos sobre esto.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue apoyada por la Fundación para la Investigación y Desarrollo del Servicio de Sangre de la Cruz Roja Flandes belga. Reconocemos el apoyo financiero proporcionado por "Bijzonder onderzoeksfond" (BOF – fondo especial de investigación) de la Universidad de Gante concedida al proyecto con número de contrato BOF30290744.
1 mL Syringe | BD | A00434 | |
10 mL Syringe | BD | 309604 | |
2 mL Syringe | BD | 307727 | |
Alexa Fluor 405 | Life Technologies | A30100 | The manufacturer's manual was followed for labeling of fibrinogen |
BD vacutainer Eclipse | Becton, Dickinson and Company | 368650 | Blood collection needle with preattached holder |
BD vacutainer tube with EDTA | Becton, Dickinson and Company | 368856 | |
BD vacutainer tube with Sodium Citrate | Becton, Dickinson and Company | 366575 | |
Blocking buffer | in house preparation | in house preparation | 1.0% (w/v) bovine serum albumin and 0.1% (w/v) glucose in HBS |
Calcein AM | Molecular probes | C1430 | |
Coagulation buffer | in house preparation | in house preparation | 10mM CaCl2 and 3.75 mM MgCl2 in HBS |
Conical tube 15mL | Greiner bio-one | 1888271 | |
Conical tube 50mL | Greiner bio-one | 227261 | |
Corn trypsin inhibitor (CTI) | Enzyme Research Laboratories | CTI | |
Denaturated alcohol | Fiers | T0011.5 | |
DiOC6 | Sigma-Aldrich | 318426 | 3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide – 1mM solution in DMSO |
Exigo microfluidic pump | Cellix | EXIGO-PC-FS7.0-MF | |
Fibrinogen | Sigma-Aldrich | F3879 | Labelled in house with AF 405 – stock concentration 10.7 mg/mL |
Hematology analyzer | Sysmex | pocH-100i | |
HEPES buffered saline (HBS) | in house preparation | in house preparation | 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) buffered saline (0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4 |
Horm Collagen | Takeda/Nycomed | 1130630 | Native equine tendon collagen (type I) Isotonic glucose solution to dilute collagen is supplemented |
Humidified box | Cellix | HUMID-BOX | |
Incubation water bath | GFL | 1013 | |
Microscope | Zeiss | Axio Observer Z1 | equipped with a colibri-LED and high resolution CCD camera |
Mirus Evo Nanopump | Cellix | 188-MIRUS-PUMP-EVO | with Multiflow8 |
Pipette | Brand | A03429 | |
Pipette tips 100-1000 | Greiner bio-one | 740290 | |
Pipette tips 1-10 | Eppendorf | A08928 | |
Pipette tips 2-200 | Greiner bio-one | 739280 | |
Platelet concentrate orbital shaker | Helmer | PF-48i | |
Precision wipes | Kimtech | 5511 | |
Pepsin solution | Hanna instrument | HI7073L | 2g pepsin per 75 ml solution, Protein cleaning solution with pepsin |
Recombinant Human Tissue Factor Innovin | Dade Berhing | B4212-40 | rhTF with synthetic phospholipids |
Software microscope | Zeiss | N/A | ZEN 2012 |
Sterile docking device | Terumo BCT | TSCD | |
Table Top Centrifuge | Eppendorf | 521-0095 | |
Tube Roller | Ratek | BTR5-12V | |
Tubing Sealer | Terumo BCT | AC-155 | |
Vena8 syringe connector pin | Cellix | CONNECTORS-B1IC-PACK100 | |
Vena8 Fluoro+ Biochips | Cellix | 188V8CF-400-100-02P10 | Coated biochip |
Vena8 Needles | Cellix | SS-P-B1IC-B1OC-PACK200 | |
Vena8 Tubing | Cellix | TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F | |
VenaDelta Y1 Biochips | Cellix | VDY1-400-100-01-02 | Mixing biochip |
Vortex mixer | VWR | 58816-121 | |
ZEN2012 software | Zeiss |