نحن تصف إنشاء الأورام القولون والمستقيم مثلي عن طريق حقن الخلايا السرطانية أو أورغانويدس في الأعور من الفئران والعزلة اللاحقة من الخلايا السرطانية المتداولة (كتس) من هذا النموذج.
على الرغم من مزايا سهولة تطبيق وفعالية من حيث التكلفة، ونماذج الماوس تحت الجلد لديها قيود شديدة ولا محاكاة بدقة علم الأورام الورم ونشر الخلايا السرطانية. تم إدخال نماذج الفئران المثلي للتغلب على هذه القيود؛ ومع ذلك، فإن مثل هذه النماذج تتطلب من الناحية الفنية، وخاصة في أجهزة أجوف مثل الأمعاء الكبيرة. من أجل إنتاج الأورام موحدة التي تنمو بشكل موثوق و ميتاستاسيزي، تقنيات موحدة لإعداد الخلايا السرطانية والحقن هي الحاسمة.
قمنا بتطوير نموذج الماوس مثلي من سرطان القولون والمستقيم (كرك) الذي يتطور الأورام موحدة للغاية، ويمكن استخدامها لدراسات البيولوجيا الورم وكذلك التجارب العلاجية. يتم حقن الخلايا السرطانية من أورام أولية، وخلايا الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) أو أورغانويد ثلاثي الأبعاد (3D) في الأعور، وبناء على إمكانات النقيلي للخلايا الورم حقن، تشكل الأورام النقيلي للغاية. بالإضافة الى،يمكن العثور على كتس بانتظام. نحن هنا وصف تقنية إعداد الخلايا السرطانية من كل من خطوط الخلايا 2D و أورغانويدز 3D وكذلك الأنسجة الورم الأولية، وتقنيات الجراحية والحقن وكذلك عزل كتس من الفئران الحاملة للورم، وتقديم نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
سرطان القولون والمستقيم (كرك) هو واحد من أكثر الأسباب شيوعا لوفاة السرطان في البلدان الغربية. 1 في حين أن الورم الرئيسي يمكن في كثير من الأحيان أن تقترن، وقوع الانبثاث البعيدة بشكل كبير يفاقم التكهن وغالبا ما يؤدي إلى الموت. 2 ، 3 الارتباط البيولوجي للانبثاث هو الخلايا السرطانية المتداولة (كتس)، التي فصل من الورم، والبقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية، نعلق على ظهارة في الجهاز المستهدف، وغزو الجهاز وتنتشر في نهاية المطاف إلى آفات جديدة. 4 على الرغم من أن كتس معروفة لتكون ذات أهمية النذير، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 بيولوجيا فهمها جزئيا فقط نتيجة لندرة المدقع في كرك. 10
نماذج الماوس هي ر قويةأول لدراسة مختلف جوانب البيولوجيا السرطان. يتم إنتاج نماذج الورم الكلاسيكية تحت الجلد عن طريق الحقن تحت الجلد من الخلايا السرطانية في الفئران المتلقي، والتي يمكن أن تكون إما إمونوكومبيتنت (إذا تم استخدام الخلايا السرطانية الفئران جينجينيك) أو نقص المناعة. نماذج الورم تحت الجلد غير مكلفة وإنتاج البيانات بسرعة. ونمو نقطة نهاية الورم يمكن بسهولة وقياس غير جراحية. ومع ذلك، 88٪ من المركبات الجديدة التي أظهرت النشاط المضاد للورم في مثل هذه النماذج تفشل في التجارب السريرية. 11 ويرجع ذلك جزئيا إلى الاختلافات بين الجنسين بين البشر والفئران. ومع ذلك، فإن جزءا كبيرا من هذا الفشل يرجع إلى انخفاض قيمة تنبؤية من نماذج الماوس تحت الجلد.
نماذج الماوس الفصلي، التي يتم فيها حقن الخلايا السرطانية في الجهاز الأصلي ومن ثم تنمو في المكروية الأصلية، وبالتالي تستخدم على نحو متزايد في أبحاث السرطان. 11 ، 12 ، </sأوب> 13 ، 14 نماذج منظار لا محاكاة فقط نمو الأورام المحلية الظروف؛ نتيجة لموقع تشريح التشريحية من نمو الورم، نماذج الماوس مثلي تسمح أيضا محاكاة واقعية للانبثاث، وبالتالي تستخدم لدراسة كتك البيولوجيا 8 ، 15 ، 16 أو ردهم على العلاجات المختلفة في كرك. 13 ، 17
وهناك عيب رئيسي من نماذج الماوس مثلي هو التعقيد الفني. اعتمادا على الجهاز الذي يتم حقن الخلايا، ومنحنى التعلم حتى المجرب هو قادرة على حث الأورام استنساخه طويلة نوعا ما. وهذا ينطبق بشكل خاص على نماذج سرطان القولون والمستقيم، كما تحتاج الخلايا السرطانية إلى أن يتم حقنه في جدار الأمعاء، والذي غالبا ما يؤدي إلى ثقب، تسرب الخلايا السرطانية أو إندولومينال فقدان الخلايا السرطانية. هذاويهدف رتيكل لوصف طريقة إعداد الخلايا من عينات الأنسجة الأولية، وخطوط الخلايا 2D وثقافة أورغانويد 3D وحقنها في الأعور من الفئران. تقنية الموصوفة هنا يؤدي إلى الأورام موحدة للغاية، اعتمادا على بيولوجيا الورم من خط الخلية المستخدمة للحقن، تشكيل استنساخ الانبثاث البعيد و كتس في الفئران المتلقي. 15
على الرغم من نشاطها ثبت قبل السريرية في نماذج الماوس تحت الجلد، فإن الغالبية العظمى من المركبات الرواية تفشل في التجارب السريرية وأبدا تصل إلى العيادة. 11 وقد أدى هذا القصور الواضح من نماذج الماوس تحت الجلد لمحاكاة بدقة أنماط البيولوجيا والنمو من الأورا?…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل مؤسسة الأبحاث الألمانية (وي 3548 / 4-1) و رولاند-إرنست-ستيفتنغ فور جيسونديتسويسن (1/14).
Cell culture Media and Components | |||
Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical Equipment | |||
Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
Buprenorphine | Temgesic | – | |
Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CTC isolation | |||
EDTA | Roth | 8040.1 | |
Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
PAP pen | Abcam | ab2601 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunohistochemistry | |||
Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |