Isolatie van circulerende tumorcellen in een orthotopische muismodel van colorectale kanker
Summary
We beschrijven de oprichting van orthotopische colorectale tumoren via injectie van tumorcellen of organoïden in de cecum van muizen en de daaropvolgende isolatie van circulerende tumorcellen (CTC's) uit dit model.
Abstract
Ondanks de voordelen van makkelijke toepasselijkheid en kosteneffectiviteit, hebben subcutane muismodellen ernstige beperkingen en worden de tumorbiologie en tumorcel-verspreiding niet nauwkeurig gesimuleerd. Orthotopische muismodellen zijn geïntroduceerd om deze beperkingen te overwinnen; Dergelijke modellen zijn echter technisch veeleisend, vooral in holle organen zoals de dikke darm. Om uniforme tumoren te produceren die op betrouwbare wijze groeien en metastaseren, zijn gestandaardiseerde technieken van tumorcelbereiding en injectie kritisch.
We hebben een orthotopisch muismodel van colorectale kanker (CRC) ontwikkeld die zeer uniforme tumoren ontwikkelt en kan gebruikt worden voor tumorbiologie studies en therapeutische proeven. Tumorcellen uit primaire tumoren, 2-dimensionale (2D) cellijnen of 3-dimensionale (3D) organoïden worden geïnjecteerd in de cecum en, afhankelijk van het metastatische potentieel van de geïnjecteerde tumorcellen, vormen zeer metastatische tumoren. Daarnaast,CTC's kunnen regelmatig worden gevonden. Hier beschrijven we de techniek van tumorcelbereiding uit zowel 2D-cellijnen als 3D-organoïden, evenals primair tumorweefsel, de chirurgische en injectietechnieken, alsmede de isolatie van CTC's uit de tumorhoudende muizen en de huidige tips voor het oplossen van problemen.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is een van de meest voorkomende oorzaken van kanker dood in westerse landen. 1 Terwijl de primaire tumor vaak kan worden geresecteerd, verergert het voorkomen van verre metastasen de prognose dramatisch en leidt vaak tot de dood. 2 , 3 Het biologische correlaat van de metastase is circulerende tumorcellen (CTC's), die losmaken van de tumor, in de circulatie overleven, aan het epithelium in het doelorgaan vallen, het orgaan binnendringen en uiteindelijk uitgroeien tot nieuwe letsels. 4 Hoewel CTC's van prognostische relevantie bekend zijn, zijn 5 , 6 , 7 , 8 , 9 hun biologie slechts gedeeltelijk begrepen als gevolg van hun uiterste zeldzaamheid in CRC. 10
Muismodellen zijn een krachtige tOol om diverse aspecten van kankerbiologie te bestuderen. Klassieke subcutane tumormodellen worden geproduceerd door subcutane injectie van tumorcellen in ontvangermuizen, die immunocompetente kunnen zijn (indien syngeneuze muizen tumorcellen worden gebruikt) of immunodeficient. Subcutane tumormodellen zijn goedkoop en produceren data snel; Hun eindpunt tumor groei kan gemakkelijk en niet-invasieve gemeten worden. 88% van de nieuwe verbindingen die antitumoractiviteit in dergelijke modellen hebben aangetoond, falen echter in klinische studies. 11 Dit is mede te danken aan interspecies verschillen tussen mensen en muizen; Een groot deel van deze mislukking is echter te wijten aan de lage voorspellende waarde van subcutane muismodellen.
Orthotopische muismodellen, waarin de tumorcellen worden geïnjecteerd in het orgaan van herkomst en dus groeien in hun oorspronkelijke micro-omgeving, worden daarom steeds meer gebruikt bij kankeronderzoek. 11 , 12 , </sUp> 13 , 14 Orthotopische modellen simuleren niet alleen lokale tumorgroei condities; Door de anatomisch correcte plaats van tumorgroei kunnen orthotopische muismodellen ook realistische simulatie van metastase mogelijk maken en worden daarom gebruikt om CTC biologie 8 , 15 , 16 of hun reactie op verschillende behandelingen in CRC te bestuderen. 13 , 17
Een belangrijk nadeel van orthotopische muismodellen is hun technische complexiteit. Afhankelijk van het orgaan waarin de cellen worden geïnjecteerd, is de leercurve tot de experimentator in staat om reproduceerbare tumoren te induceren, vrij lang. Dit geldt vooral voor colonectale kankermodellen, aangezien de tumorcellen in de darmmuur moeten worden geïnjecteerd, wat vaak resulteert in perforatie, tumorcellekkage of endoluminale tumorcelverlies. Dit isArtikel is bedoeld om de methode van celbereiding te beschrijven van primaire weefselmonsters, 2D-cellijnen en 3D-organoidcultuur en hun injectie in de cecum van muizen. De hier beschreven techniek leidt tot zeer gelijkmatige tumoren en, afhankelijk van de tumorbiologie van de cellijn die gebruikt wordt voor injectie, reproduceerbare vorming van verre metastasen en CTC's in de ontvanger muizen. 15
Protocol
Representative Results
Discussion
Ondanks hun preclinisch bewezen activiteit in subcutane muismodellen, falen de grote meerderheid van de nieuwe verbindingen in klinische proeven en bereiken ze nooit de kliniek. 11 Deze duidelijke tekort aan subcutane muismodellen om de biologie en groeipatronen van tumoren nauwkeurig te simuleren heeft geleid tot de ontwikkeling van orthotopische muismodellen op basis van de injectie van tumorcellen direct in het oorspronkelijke orgaan.
Orthotopische muismodellen kun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (WE 3548 / 4-1) en Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).
Materials
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine | Temgesic | – | |
| Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
- Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
- Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
- Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
- Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
- Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?. Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
- Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
- Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
- Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
- Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
- Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201 (2015).
- Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
- Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
- van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82 (2013).
- Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
- Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484 (2007).
- Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
- Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
- Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107 (2014).
- Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
- Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
- Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
- Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).
