대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리
Summary
우리는 마우스의 맹장에 종양 세포 또는 유기체를 주입하고이 모델에서 순환하는 종양 세포 (CTCs)를 분리하여 정형 적 대장 직장 종양의 형성을 기술합니다.
Abstract
쉬운 적용 성과 비용 효율성이라는 장점에도 불구하고 피하 조직 마우스 모델에는 심각한 한계가 있으며 종양 생물학 및 종양 세포 보급을 정확하게 시뮬레이트하지 못합니다. Orthotopic 마우스 모델은 이러한 한계를 극복하기 위해 도입되었습니다. 그러나 이러한 모델은 기술적으로 까다로운 기관, 특히 대장과 같은 기관에서 요구됩니다. 신뢰할 수있게 성장하고 전이하는 균일 한 종양을 생산하기 위해서는 종양 세포 준비 및 주사의 표준화 된 기술이 중요합니다.
우리는 매우 균일 한 종양을 발생시키고 종양 생물학 연구 및 치료 임상 시험에 사용될 수있는 대장 암 (orthoreopic mouse)의 대장 암 모델 (CRC)을 개발했습니다. 원발성 종양, 2 차원 (2D) 세포주 또는 3 차원 (3D) 조직 종양의 종양 세포가 맹장에 주입되어 주입 된 종양 세포의 전이 잠재성에 따라 고도로 전이 된 종양을 형성합니다. 게다가,CTC는 정기적으로 발견 할 수 있습니다. 우리는 종양 보유 마우스로부터의 CTCs의 격리뿐만 아니라 외과 및 주사 기술뿐만 아니라 일차 종양 조직뿐만 아니라 2D 세포주 및 3D 유기체 모두로부터의 종양 세포 제조 기술 및 문제 해결을위한 현재의 팁을 기술한다.
Introduction
Colorectal cancer (CRC)는 서구 국가에서 암으로 사망하는 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 차 종양은 종종 절제 할 수 있지만 1, 원격 전이의 발생은 극적으로 죽음에 이르게 종종 예후를 악화합니다. 2 , 3 전이의 생물학적 상관 관계는 종양에서 분리되어 순환하면서 생존하며 표적 기관의 상피에 부착하고 장기를 침범하여 궁극적으로 새로운 병변으로 자라는 순환하는 종양 세포 (CTC)입니다. CTCS이 예후 관련성, 5, 6, 7, 8의 것으로 알려져 있지만 (4), (9) 그 생물은 부분적 CRC에서의 극단적 인 희귀 한 결과로 이해된다. 10
마우스 모델은 강력한 기능입니다.암 생물학의 다양한 측면을 연구합니다. 종양 세포를 면역 접종 (동종 쥐 종양 세포를 사용하는 경우) 또는 면역 결핍 일 수있는 수령 마우스에 피하 주사하여 고전적이고 피하 종양 모델을 생성합니다. 피하 종양 모델은 저렴하고 빠른 데이터를 생성합니다. 그들의 종점 종양 성장은 용이하고 비 침습적으로 측정 될 수있다. 그러나, 그러한 모델에서 항 종양 활성을 입증 한 새로운 화합물의 88 %가 임상 시험에서 실패합니다. 11 이것은 부분적으로 인간과 쥐 사이의 종간의 차이로 인한 것이다. 그러나이 실패의 대부분은 피하 조직 마우스 모델의 예측 가치가 낮기 때문입니다.
종양 세포가 기원 기관에 주입되어 원래의 미세 환경에서 성장하는 정형 마우스 모델은 암 연구에 점점 더 많이 사용됩니다. 11 , 12 , </sup> 13 , 14 Orthotopic 모델은 국소 종양 성장 조건을 시뮬레이션 할뿐만 아니라, 해부학 적으로 정확한 종양 성장 부위의 결과로, 정위 마우스 모델은 또한 전이의 현실적인 시뮬레이션을 가능하게하여 CTC 생물학 8 , 15 , 16 또는 CRC의 다른 치료법에 대한 반응을 연구하는 데 사용됩니다. 13 , 17
orthotopic 마우스 모델의 주요 단점은 기술적 인 복잡성입니다. 세포가 주입되어야하는 기관에 따라, 실험자가 재현 할 수있는 종양을 유도 할 수있을 때까지 학습 곡선은 오히려 길다. 종양 세포를 장 벽에 주입해야하기 때문에 대장 암 모델에 특히 적용됩니다. 종양 세포는 종종 천공, 종양 세포 누출 또는 종양 세포 종양 감소를 초래합니다. 이것은연구는 1 차 조직 샘플, 2 차원 세포주 및 3 차원 유기체 배양과 맹장 (맹장)으로의 세포 준비 방법을 설명하기위한 것입니다. 여기에 기술 된 기술은 고도로 균일 한 종양을 유도하고, 주입에 사용 된 세포주의 종양 생물학적 특성에 따라 수혜자 마우스에서 먼 전이 및 CTCs의 재현성있는 형성을 유도합니다. 15 명
Protocol
여기에 제시된 동물 실험은 기관 및 정부 동물 관리 및 사용위원회가 독립적으로 검토 및 승인했으며 실험 동물 학회 연맹 (FELASA) 지침에 따라 실시되었습니다. 모든 가능한 조치는 마취 및 진통제, 또는 필요한 경우 조기 안락사를 비롯한 고통을 최소화하기 위해 취해졌습니다. 1. 세포 및 organoids의 준비 참고 : 각 주입마다 100,000 개의 셀을 사용하?…
Representative Results
이 모델에서 대장 암 종양의 성공적이고 재현성있는 생성은 유출이나 누출없이 세포의 정확한 주입에 결정적으로 달려 있습니다. 이것이 성취된다면,이 모델은 매우 신뢰할 만하 며, 인공 복막염을 유발하는 경우는 거의 없습니다. 종양의 성장 동력학 및 그것의 보급 패턴은 사용 된 유기체 및 세포의 생물학적 특성에 달려있다. HCT116 세포가 안정적으로이 모델에서 간으?…
Discussion
피하 조직 마우스 모델에서 전임상으로 입증 된 활동에도 불구하고, 대다수의 새로운 화합물은 임상 시험에서 실패하고 결코 클리닉에 도달하지 못합니다. 11 피하 마우스 모델의이 명백한 부족 정확하게 종양의 생물학 및 성장 패턴을 직접 원래의 장기에 종양 세포의 주입에 따라 동소 마우스 모델의 개발을 주도하고있다 시뮬레이션합니다.
Orthotopic 마우?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 독일 연구 재단 (WE 3548 / 4-1)과 Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14)의 지원을 받았다.
Materials
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine | Temgesic | – | |
| Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
Referências
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Citar este artigo
Kochall, S., Thepkaysone, M., García, S. A., Betzler, A. M., Weitz, J., Reissfelder, C., Schölch, S. Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer. J. Vis. Exp. (125), e55357, doi:10.3791/55357 (2017).