Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal
Summary
Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.
Abstract
Apesar das vantagens de uma fácil aplicabilidade e custo-eficácia, os modelos de ratos subcutâneos têm limitações severas e não simulam com precisão a biologia do tumor e a disseminação de células tumorais. Modelos de mouse ortotópicos foram introduzidos para superar essas limitações; No entanto, esses modelos são tecnicamente exigentes, especialmente em órgãos vazios, como o intestino grosso. Para produzir tumores uniformes que crescem e metastatizam de forma confiável, são críticas técnicas padronizadas de preparação e injeção de células tumorais.
Desenvolvemos um modelo de câncer colorretal ortopsico (CRC) que desenvolve tumores altamente uniformes e pode ser utilizado para estudos de biologia tumoral, bem como ensaios terapêuticos. As células tumorais de ambos os tumores primários, linhas celulares bidimensionais (2D) ou organoides tridimensionais (3D) são injetadas no ceco e, dependendo do potencial metastático das células tumorais injetadas, formam tumores altamente metastáticos. Além do que, além do mais,Os CTCs podem ser encontrados regularmente. Aqui descrevemos a técnica de preparação de células tumorais a partir de linhas celulares 2D e organoídeos 3D, bem como tecido tumoral primário, técnicas cirúrgicas e de injeção, bem como o isolamento de CTCs dos camundongos portadores de tumor e dicas atuais para solução de problemas.
Introduction
O câncer colorretal (CRC) é uma das causas mais comuns de morte por câncer nos países ocidentais. 1 Embora o tumor primário possa ser frequentemente ressecado, a ocorrência de metástases à distância piora dramaticamente o prognóstico e muitas vezes leva à morte. 2 , 3 A correlação biológica da metástase é a circulação de células tumorais (CTCs), que se destacam do tumor, sobrevivem em circulação, se juntam ao epitélio no órgão alvo, invadem o órgão e, finalmente, superam novas lesões. 4 Embora os CTCs sejam de relevância prognóstica, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , sua biologia é parcialmente entendida como resultado de sua extrema raridade no CRC. 10
Os modelos de mouse são um poderoso tOol para estudar vários aspectos da biologia do câncer. Os modelos clássicos de tumor subcutâneo são produzidos por injeção subcutânea de células tumorais em camundongos receptores, que podem ser imunocompetentes (se forem utilizadas células de tumor murino singenésicas) ou imunodeficientes. Os modelos de tumor subcutâneo são baratos e produzem dados rapidamente; Seu crescimento de tumor de ponto final pode ser medido facilmente e não invasivamente. No entanto, 88% dos novos compostos que demonstraram atividade antitumoral em tais modelos falham nos ensaios clínicos. 11 Isto é em parte devido a diferenças entre espécies entre humanos e camundongos; No entanto, uma grande parte dessa falha é devido ao baixo valor preditivo de modelos subcutâneos de mouse.
Os modelos de ratos ortotópicos, nos quais as células tumorais são injetadas no órgão de origem e, portanto, crescem em seu microambiente original, são, portanto, cada vez mais utilizados na pesquisa do câncer. 11 , 12 , </sUp> 13 , 14 Os modelos ortotópicos não apenas simulam as condições locais de crescimento tumoral; Como resultado do sítio anatômico correto do crescimento tumoral, os modelos de ratos ortotópicos também permitem a simulação realista de metástases e, portanto, são usados para estudar biologia 8 , 15 e 16 de CTC ou sua resposta a diferentes tratamentos em CRC. 13 , 17
Uma grande desvantagem dos modelos de mouse ortotópicos é a sua complexidade técnica. Dependendo do órgão em que as células devem ser injetadas, a curva de aprendizado até que o experimentador seja capaz de induzir tumores reprodutíveis é bastante longa. Isto aplica-se especialmente aos modelos de câncer colorretal, uma vez que as células tumorais precisam ser injetadas na parede intestinal, o que muitas vezes resulta em perfuração, vazamento de células tumorais ou perda de células tumorais endoluminais. Isso é umO artigo pretende descrever o método de preparação celular a partir de amostras de tecido primário, linhas celulares 2D e cultura organo 3D e sua injeção no ceco de camundongos. A técnica descrita aqui leva a tumores altamente uniformes e, dependendo da biologia do tumor da linha celular usada para injeção, a formação reprodutível de metástases à distância e CTC nos camundongos receptores. 15
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar de sua atividade pré-clinicamente comprovada em modelos de ratos subcutâneos, a grande maioria dos novos compostos falha em ensaios clínicos e nunca atinge a clínica. 11 Esta óbvia insuficiência de modelos subcutâneos de ratos para simular com precisão a biologia e os padrões de crescimento dos tumores levou ao desenvolvimento de modelos de ratos ortotópicos baseados na injeção de células tumorais diretamente no órgão original.
Os modelos de rato…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Pesquisa Alemã (WE 3548 / 4-1) e Roland-Ernst-Stiftung für Gesundheitswesen (1/14).
Materials
| Cell culture Media and Components | |||
| Advanced DMEM F12 | Invitrogen | 12634010 | DMEM/ F12 +++ medium |
| HEPES (1 M) | Life Technologies GmbH | 15630056 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Glutamax-I Supplement (200 mM) | Life Technologies GmbH | 35050038 | DMEM/ F12 +++ medium |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | DMEM/ F12 +++ medium |
| DMEM | Life Technologies GmbH | 61965026 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | basic medium of 2D cell lines (DMEM/10%FCS) |
| TrypLE Express enzymatic dissociation buffer | Life Technologies GmbH | 12604021 | |
| Matrigel basement membrane matrix (BMM, phenol red free) | CORNING B.V. Life Sciences | 356231 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | |
| Trypsin-EDTA (0,25%, Phenol-Red) | Life Technologies GmbH | 25200072 | |
| 6-/48-well plates with lid | CORNING | 3516/3548 | |
| cell culture flask 75cm², 250 mL | VWR International GmbH | 734-2066 | |
| cell culture flask 150cm², 600 mL | Corning B.V. Life Sciences | 355001 | |
| Eppendorf tubes 1,5 mL / 2 mL | Sarstedt AG & Co. | 72.706.400/ 72.695.400 | |
| 15 ml, 50 ml centrifuge tubes | Greiner-Bio-One GmbH | 188271/227270 | |
| TC10 Counting Slides (for TC20 Counting Machine) | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1450016 | |
| Pasteur pipettes (glass, 150 mm) | Fisher Scientific GmbH | 11546963/ FB50251 | thinly pulled by using a bunsen burner |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | for primary tumor tissue preparation |
| MACSmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | for primary tumor tissue preparation |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | for primary tumor tissue preparation |
| Human Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | for primary tumor tissue preparation |
| Falcon 70µm Cell Strainer | Corning B.V. Life Sciences | 352350 | for primary tumor tissue preparation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Equipment | |||
| Sevoflurane | AbbVie Germany GmbH & Co. KG | – | |
| Medical oxygen | Air Liquide Medical GmbH | – | |
| Buprenorphine | Temgesic | – | |
| Bepanthen – opthalmic ointment | Bayer Vital GmbH | 10047757 | |
| Normal saline 0.9% (E154) | Serumwerk Bernburg AG | 10013 | |
| Aqua ad injectabilia | Braun | 235144 | |
| 1 mL Syringe (without dead volume) – Injekt-F SOLO | Braun/neoLab | 194291661 | |
| 30G injection needle | BECTON DICKINSON | 304000 | |
| cellulose swabs | Lohmann & Rauscher Deutschland | 13356 | |
| Micro-Adson Forceps | FST – Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Iris Scissor – ToughCut | FST – Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Olsen-Hegar Needle Holder | FST – Fine Science Tools | 12002-12 | |
| AutoClip Kit | FST – Fine Science Tools | 12020-00 | |
| PDS Z1012H 6/0 C1 (surgical suture) | Johnson & Johnson Medical GmbH | Z1012H | |
| Table Top Research Anesthesia Machine w/O2 Flush and a Sevoflurane Vaporizer | Parkland Scientific | V3000PS/PK | |
| UltraMicro Pump with Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-4 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Footswitch for SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | 15867 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Three-axis Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M325 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Magnetic Stand for Micromanipulator | World Precision Instruments | M10 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Steel Base Plate for M10 Magnetic Stand | World Precision Instruments | 5479 | equipment for highly controlled orthotopic injection |
| Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
| Isis – Hair shaver | AESCULAP – Braun | – | |
| Binocular Surgical Microscope | Parkland Scientific | VS-2Z | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CTC isolation | |||
| EDTA | Roth | 8040.1 | |
| Density gradient medium – Ficoll | StemCell – Lymphoprep | 7801 | |
| Alexa Fluor 488 anti-human CD326 (EpCAM) Antibody clone 9C4 | BioLegend | 324210 | |
| Alexa Fluor 488 anti-mouse CD326 (EpCAM) Antibody clone G8.8 | BioLegend | 118210 | |
| Petri Dish, ø 60 x 15 mm, 21 cm², Vent | Greiner bio-one | 628102 | |
| Fluorescence Cell Culture Microscope | Leica | ||
| Transferman 4r Micromanipulator | Eppendorf | ||
| CellTram Air | Eppendorf | aspiration pump connected to the micromanipulator | |
| Dmz Universal Microelectrode Puller | Dagan Corporation | required for the manufacturing of micro capillaries for single cell aspiration | |
| Prism Glass Capillaries | Dagan Corporation | ||
| PAP pen | Abcam | ab2601 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Life Technologies GmbH | 14190169 | picking buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | BIOCHROM AG | S 0115 | picking buffer |
| Penicillin/Streptomycin (PenStrep) | Life Technologies GmbH | 15140122 | picking buffer |
| EDTA | Roth | 8040.1 | picking buffer |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Purified anti-human CD326 (EpCAM) antibody clone 9C4 | BioLegend | 324201 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
| HRP rabbit anti-mouse IgG | Abcam | ab97046 | EpCAM immunohistochemistry (cf, fig 2C) |
Referências
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