Последовательные соли экстракции для анализа массовых Chromatin привязки свойств Chromatin изменения комплексы
Summary
Последовательные добыча соли хроматина связаны белков является полезным инструментом для определения свойств привязки крупных белковых комплексов. Этот метод может использоваться для оценки роли отдельных подразделений или домены в общей схожести белкового комплекса для массового хроматина.
Abstract
Выяснения свойств привязки хроматина таргетинг белков может быть очень сложным из-за сложного характера хроматина и неоднородный характер наиболее млекопитающих chromatin изменения комплексов. Чтобы преодолеть эти препятствия, мы адаптировали assay последовательный добыча соли (SSE) для оценки относительной привязки сходство хроматина привязанных комплексов. Этот простой и простой assay может использоваться не-экспертов для оценки относительной разницы в обязательную силу сходства двух соответствующих комплексов, изменения в близость комплекса когда субъединицы теряется или инактивированная отдельный домен, и изменения в сродство после изменения ландшафта хроматина. Приостановив последовательно повторно массовых хроматина в увеличении количества соли, мы способны профиль элюции белка от хроматина. Используя эти профили, мы в состоянии определить, как изменения в комплексе chromatin изменения или изменения в окружающей среде хроматина влияют на привязки взаимодействия. Муфта SSE с другими в пробирке и в естественных условиях анализов, мы можем определить роли отдельных доменов и белков на функциональность комплекса в различных средах хроматина.
Introduction
Регулирование ДНК в эукариотических клеток является сложной и сложной системы, которая жестко контролируется ассортимент белков, которые координируют ответы на внутриклеточные и внеклеточной стимулы. ДНК оборачивают вокруг гистона octamers к форме нуклеосом, которые могут быть свободно распространяется вдоль ДНК или уплотняется в жесткой катушек1. Этот структурный механизм ДНК и гистонов известен как хроматина, которая регулируется сеть белков, которые читать, писать и стереть сообщение поступательные изменения (ПТМ) гистонами2. Некоторые гистона PTMs, таких как ацетилирования, изменить заряд аминокислоты, которые они оседают на, изменяя взаимодействие между гистонами и ДНК2. Гистона PTMs также служат для набирать транскрипционный анализ регуляторов, ремонтом хроматина, ДНК повреждения ремонт техники и механизма репликации ДНК для конкретных регионов генома3.
Большинство методов для изучения взаимодействия хроматина зонд взаимодействия малых масштабах или привлекать большие генома широкий анализ. В vitro исследования привязки часто используют отдельные рекомбинантных домены с гистонов пептидов или ДНК в анализов таких анализов сдвиг мобильность электрофореза (EMSA), изотермический титрования калориметрии, поляризации флуоресценции и pulldowns пептида. Потому что эти анализы обычно сосредоточены на домене индивидуальных белков, они облегчают понимание небольшой кусок головоломки, но не позволяют нам понять кооперативного характера многодоменной белки, не говоря уже о их роли в нескольких белка комплексы. Еще один слой сложность добавляется гетерогенных состав наиболее млекопитающих chromatin изменения комплексов. Эта разнородность белка, в сочетании с динамичный характер ландшафта хроматина, делает его сложно резюмировать в естественных условиях привязки взаимодействия белков хроматина хроматина в пробирке.
В естественных условиях методы добились значительных успехов; Однако они часто дорого, много времени и технически сложным. Иммунопреципитации Chromatin, следуют виртуализации (чип seq) является весьма полезной для определения локализации белков и изменения гистона по всему геному, однако она требует существенной оптимизации4. Белки являются часто высокоструктурированные chromatin для сохранения взаимодействия; Однако это может производить искусственные взаимодействий и может вызвать epitope маскировки5. Кроме того immunoprecipitations (IP) требуют весьма специфических антител и обширные оптимизации ДНК стрижка и IP условий по чип ПЦР с помощью известных привязки сайта, который часто не доступны априори. После оптимизации условий чип обработка образцов является дорогостоящим и требует нескольких недель до месяцев последовательности и анализировать. Хотя этот метод имеет неоценимое значение для выявления локализации хроматина привязывается белки по всему геному, стоимость и время обязательство сделать это непомерно использовать этот метод для генерации гипотез о как небольшие изменения могут повлиять на глобальные привязки свойства .
В этой статье мы описываем, как пробирного последовательный добыча соли (SSE) может использоваться для изучения глобальных привязки профили хроматина прыгните белков и различие, как изменения в профиль белка, сложные, или глобальной PTM может изменять взаимодействий. Хотя соль зубов часто и широко используемый метод, мы демонстрируем, как этот последовательный метод высокую воспроизводимость и универсальным. SSE позволяет характеризовать как один Субблок комплекс или даже одного домена способствует общий комплекс сродство для сыпучих хроматина. SSE может также использоваться для определения, если привязка белка находится под влиянием изменения в ландшафте хроматина, предоставляя интересные гипотезы для гистона Марк ориентации, которые могут быть подтверждены с помощью чип seq и другие исследования генома широкий.
Первоначально мы адаптировали этот метод из Wu et al., изучить функции Polybromo1 (PBRM1) в привязке PBAF хроматина remodeler6,7. Используя эту технику, мы определены роли PBRM1 для привязки хроматина в пределах PBAF хроматина, реконструкции комплекса и затем определить относительный вклад шести отдельных bromodomains этой функции7.
Здесь мы опишем, как оптимизировать этот метод для изучения привязки хроматина в различных типов клеток, чтобы оценить относительная сродство аналогичные хроматина, изменяя комплексы, для изучения перемещения белка от хроматина, химического ингибитор, и определить эффекты хроматина привязки после изменения ландшафта хроматина.
Protocol
Representative Results
Discussion
Характеристика белков и хроматина взаимодействий через соль экстракции является общий метод, который был нанят для десятилетий14,15; Однако он не был оптимизирован систематически прежде чем раскрыть свою полезность. Мы демонстрируем, как этот последоват?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана премию ученый V (V2014-004) и V ученый плюс премии (D2016-030) от V Фонд исследований рака и американский рак общества институциональных исследовательский грант (ACS IRG Грант 58-006-53) к центру Университета Purdue для рака Исследования. E. G. P. было поддержано Borch выпускник Дотационный награду Purdue университета лекарственных химии и молекулярной фармакологии Департамента.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
Referências
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes–many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -. M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta – Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
