Controleerbaar Ion Channel Expression door middel Induceerbare tijdelijke transfectie
Summary
Het bestuderen van ionkanalen via een heteroloog tot expressie brengen systeem is uitgegroeid tot een kern techniek in het biomedisch onderzoek. In dit manuscript presenteren we een tijd efficiënte methode om strak ionkanaal expressie te komen door het uitvoeren transiënte transfectie onder controle van een induceerbare promoter.
Abstract
Transfectie, de afgifte van vreemde nucleïnezuren in een cel, is een krachtig instrument eiwitonderzoek. Via deze methode kan ionkanalen worden onderzocht door middel van elektrofysiologische analyse, biochemische karakterisering, mutatie-studies, en hun effecten op cellulaire processen. Transiënte transfecties bieden een eenvoudige protocol waarin het eiwit beschikbaar voor analyse binnen enkele uren tot dagen. Hoewel deze methode geeft een relatief eenvoudig en tijdbesparend protocol, een van de belangrijkste componenten kalibreren van de expressie van het gen van belang fysiologisch relevante niveaus of niveaus die geschikt zijn voor analyse. Hiervoor verschillende benaderingen die het vermogen om de expressie van het gen van belang onder controle kunnen ontstaan. Verschillende stabiele celtransfectie protocollen bieden een manier om een gen van belang vast te introduceren in het cellulaire genoom onder de regulatie van een door tetracycline gecontroleerde transcriptionele activering. Hoewel deze techniek levert betrouwbare expressie levels, elk gen van belang vereist een paar weken van geschoold werk met inbegrip van de ijking van een moord curve, de selectie van de cel kolonies, en de algehele meer middelen. Hier presenteren we een protocol dat transiënte transfectie van de Transient Receptor Potential kationenkanaal subfamilie V lid 1 (TRPV1) gen gebruikt in een induceerbaar systeem als een efficiënte manier om een eiwit in een gecontroleerde wijze die essentieel ionkanaal tot expressie analyse. We tonen aan dat het gebruik van deze techniek kunnen wij calcium imaging, volledige cellen en enkelkanaals analyses uit te voeren met gecontroleerde kanaalniveaus voor elke type informatieverzameling bij een transfectie. Kortom, dit levert een repliceerbare techniek die kan worden gebruikt om ionkanalen structuur en functie te bestuderen.
Introduction
Heteroloog tot expressie systemen is een van de meest gebruikte technieken om een veelheid aan cellulaire functies 1 bestuderen. Hun lage endogene eiwit profiel, minimale onderhoud, betrouwbare groei, en het vermogen om op te nemen en uit te drukken vreemd DNA hebben cellijnen zoals humane embryonale nier (HEK293) en Chinese hamster ovarium (CHO) bijna essentieel voor biologisch onderzoek 2, 3 gemaakt. Gebieden van onderzoek met behulp van heterologe systemen omvatten membraaneiwitten, intracellulaire signalering en enzymatische activiteit. Na transfectie van vreemd DNA in de cel, kan veel verschillende vormen van analyse worden uitgevoerd, waaronder elektrofysiologie, calcium ratiometrische imaging, western blot, etc. 4, 5.
Vanwege het brede scala aan mogelijke toepassingen voor heterologe expressie systemen, veel different reagentia en producten zijn ontwikkeld om deze cellen en hun kwaliteiten 6 gebruiken. DNA levering systemen die kortstondig of permanent vreemd DNA te integreren in de cellen om exogeen eiwit studeren is uitgegroeid tot een van de meest populaire en handige tools voor het biologisch onderzoek. Meer specifiek wordt tijdelijk transfecteren van DNA in een cel op grote schaal gebruikt als een eenvoudige, eenvoudig proces dat relatief weinig tijd en materiaal vergt. Bovendien, het slagingspercentage van cellen die transfectie ondergaan hoog is 7. Deze techniek is zeer betrouwbaar in combinatie met een merkergen zoals groen fluorescent eiwit (GFP), en kan worden gebruikt voor veel verschillende technieken zoals calcium imaging en elektrofysiologie 5. Helaas echter tijdelijk expressie brengen van DNA in gastheercellen geleverd met een aantal valkuilen, niet in het minst het expressieniveau per cel is onbetrouwbaar. Het aantal kopieën van het plasmide-DNA genomen up per cel oncontroleerbaar, waardoor de uitdrukking tussen afzonderlijke experimenten kan sterk variëren 2. Deze kwestie wordt significant wanneer ofwel een poging om fysiologische omstandigheden te repliceren, of het uitvoeren van nauwkeurige dataverzamelingstechnieken.
Als oplossing voor de bovengenoemde stabiele transfectie protocollen ontworpen zijn complicaties waarin een gen van interesse in het genoom van een cel onder strenge controle van een induceerbare promoter, kan worden ingebracht, zoals een tetracycline repressor expressiesysteem, waardoor een kopie van de plasmide geïntegreerd in het genoom van elke cel en wordt alleen tot expressie gebracht na inductie van de transcriptie mechanisme, bijvoorbeeld in aanwezigheid van doxycycline. Hoewel dit lost de obstakels van inconsistente eiwit expressie levels, deze methode verliest het gemak van een snelle en relatief eenvoudig protocol van voorbijgaande transfecties. De oprichting van een stabiele cellijn duurt minstens een paar weken in whicfoon moet doden kromme specifieke antibiotica ingesteld op de eiwitexpressie stand te houden en integratie van de vector uitstekend selecteren en groeien celkolonies kalibreren. Over het algemeen neemt dit aanzienlijk meer tijd en moeite met een lagere slagingspercentage 8.
Hier introduceren we een tussenliggende protocol dat is gebaseerd op de sterke punten van beide van de populaire transfectie opties om een eenvoudige en effectieve manier om uitdrukking te beheersen in elke induceerbare cellijn te verschaffen. Met behoud van cellen met tet induceerbare systeem, we tijdelijk transfecteren onze gen van belang, Transient Receptor Potential kationenkanaal subfamilie V lid 1 (TRPV1), geligeerd in een vector die homoloog kan combineren met de repressor systeem. Op deze wijze kan het gen in de cellen worden ingevoerd zonder beginnen te drukken. Alleen met de toevoeging van doxycycline heeft het gen begint te drukken, zodat we het eiwitgehalte expr kalibrerensessieschijven volgens de techniek of niveaus waargenomen bij fysiologische omstandigheden. Ons protocol vermijdt ook langdurige complicaties in verband met het genereren van een stabiel tot expressie cellijn. We beginnen met het tonen van de veranderende niveaus van TRPV1 activering in calcium beeldvorming van-un geïnduceerd door middel van vier uur van de inductie en hoe de stijging in de intracellulaire calcium niveaus correleert. Vervolgens hebben we dupliceren het protocol in de gehele cel configuratie van de patch clamp techniek, met de toenemende stroom met toenemende tijd van inductie. Tenslotte, laten we voorbeelden van enkel kanaal elektrofysiologie opnamen en tonen dat deze techniek is bijzonder bruikbaar voor gecontroleerde expressie bij het zoeken naar exacte gegevensverzameling op basis van individuele eenheden van het eiwit. Door middel van ons protocol, bieden wij een handige manier om eiwit expressie in heterologe systemen aan te sturen terwijl het vermijden van langdurige celkweek complicaties, aldus een manier om de omstandigheden tussen de experimenten en bieden mo controleopnieuw reproduceerbare resultaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transfectie is een veel gebruikte protocol voor eiwitexpressie en onderzoek met veel verschillende variaties expressie consistentie en stabiliteit. Transiënte transfectie reagentia bieden een eenvoudige, makkelijk te protocol waarbij de cel en eiwit van belang in uren gedurende een nacht kan worden geanalyseerd vanaf het moment van transfectie gebruikt. Helaas is deze aanpak kan onvoorspelbaar zijn als de wijze van analyse een consistent niveau van eiwit expressie, zoals de single channel opnamen in elektrofysiologie <…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Israel Science Foundation [Grants 1721-1712, 1368-1312 en 1444-1416] (AP). AP is aangesloten bij Brettler Center en David R. Bloom Center, School of Pharmacy, de Hebreeuwse Universiteit van Jeruzalem.
Materials
| pcDNA™4/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102020 | |
| pcDNA™5/TO Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V103320 | |
| PureLink Quick PCR Purification Kit | Invitrogen | K310001 | |
| Swift™ MaxPro Thermal Cycler | Esco | n.a | |
| Restriction Enzymes | ThermoScientific Fisher | ER0501 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K210012 | |
| NanoDrop 2000c | ThermoScientific Fisher | ND-2000C | |
| T4 DNA Ligase | ThermoScientific Fisher | EL0011 | |
| One Shot® TOP10 Chemically Competent E. coli | ThermoScientific Fisher | C404006 | |
| Ampicillin (Sodium), USP Grade | Gold Bio | A-301-5 | |
| Tryptone for microbiology | Merck | 6.19305E+13 | |
| Yeast Extract | BD worldwide | 212750 | |
| SIF6000R Incubated Shaker | LAB COMPANION | 45H118 | |
NucleoSpin®plasmid |
Macherey Nagel | 740588.25 | |
| MS 300V Power Supply | Major Science | MP-300V | |
| Owl™ EasyCast™ B1A Mini Gel Electrophoresis System | ThermoScientific Fisher | B1A | |
| T-REx™-293 cell line | Invitrogen | R710-07 | |
| DMEM (1X), liquid (high glucose) | Gibco | 41965-039 | |
| HindIII-HF® | NEB | R3104S | |
| ApaI | NEB | R0114S | |
| CutSmart® Buffer | NEB | B7204S | |
| pcDNA™6/TR Mammalian Expression Vector | ThermoScientific Fisher | V102520 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin | Gibco | 10270106 | |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-Alanyl-L-Glutamine (Stable Glutamine) (200 mM) | Biological Industries | 03-022-1B | |
| Heracell™ 150i CO2 Incubator | ThermoScientific Fisher | 51026406 | |
| MSC-Advantage™ Class II Biological Safety Cabinet | ThermoScientific Fisher | 51025411 | |
| Blasticidine S hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205-25MG | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| DOUBLE NEUBAUER RULED METALLIZED HEMACYTOMETER | Hausser Scientific | 31000 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 31985070 | |
| TransIT®-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| glass coverslips, #1 thickness, 12mm diameter round | Knittel Glass | GG-12 | |
| BioCoat™ Poly-D-Lysine | Corning | 354210 | |
| Water, Cell Culture Grade | Biological Industries | 03-055-1A | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-1G | |
| Fura-2, AM ester | Biotium | BTM-50034 | |
| Pluronic® F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| µ-Slide 8 Well | ibidi | 80826 | |
| (E)-Capsaicin | Tocris | 462 | |
| Olympus IX70 Fluorescence Microscope | Olympus | n.a | |
| Lambda DG-4 Wavelength Switcher | Sutter Instruments | n.a | |
| EXi Blue Fluorescence Microscopy Camera | QImaging | n.a | |
| MetaFluor Fluorescence Ratio Imaging Software | Molecular Devices | n.a | |
| Thin Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-110-7.5HP | |
| Standard Walled Borosilicate Tubing | Sutter Instruments | B150-86-7.5HP | |
| Dimethyl sulfoxide anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| MF-900 Microforge | NARISHIGE | n.a | |
| ValveBank perfusion sysytem | AutoMate Scientific | ||
| Digidata® 1440A Low-noise Data Acquisition System | Molecular Devices | n.a | |
| Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | n.a | |
| pCLAMP 10.6 Software | Molecular Devices | n.a | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 |
Referências
- Ooi, A., Wong, A., Esau, L., Lemtiri-Chlieh, F., Gehring, C. A Guide to Transient Expression of Membrane Proteins in HEK-293 Cells for Functional Characterization. Frontiers in Physiology. 7, 300 (2016).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Xu, X., Nagarajan, H., et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 29 (8), 735-741 (2011).
- Hazan, A., Kumar, R., Matzner, H., Priel, A. The pain receptor TRPV1 displays agonist-dependent activation stoichiometry. Scientific reports. 5, 12278 (2015).
- Kumar, R., Hazan, A., Basu, A., Zalcman, N., Matzner, H., Priel, A. Tyrosine Residue in the TRPV1 Vanilloid Binding Pocket Regulates Deactivation Kinetics. Journal of Biological Chemistry. 291 (26), 13855-13863 (2016).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Preuss, A. K., Connor, J. A., Vogel, H. Transient transfection induces different intracellular calcium signaling in CHO K1 versus HEK 293 cells. Cytotechnology. 33 (1-3), 139-145 (2000).
- Dalton, A. C., Barton, W. A. Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines. Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Bohlen, C. J., Priel, A., Zhou, S., King, D., Siemens, J., Julius, D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain. Cell. 141 (5), 834-845 (2010).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflügers Archiv European journal of physiology. 391 (2), 85-100 (1981).
- Jones, J., Nivitchanyong, T., et al. Optimization of tetracycline-responsive recombinant protein production and effect on cell growth and ER stress in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 91 (6), 722-732 (2005).
- Raphemot, R., Weaver, C. D., Denton, J. S. High-throughput screening for small-molecule modulators of inward rectifier potassium channels. J Vis Exp. (71), e4209 (2013).
