Generation av iPSC härledda mänskliga hjärnan Organoids till modell Tidig nervsystemets sjukdomar

Summary

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

Abstract

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.

This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.

To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Introduction

Mänskliga nervsjukdomar, såsom mikrocefali, bara kan vara dåligt studerats i djurmodeller på grund av det faktum att mänskliga hjärnor har en utökad kortikala ytan, en unik funktion som skiljer sig från icke-mänskliga djur.

Denna aspekt gör mänsklig hjärnans utveckling en komplex process som inte i tillräcklig utsträckning kan studeras i en 2D, in vitro cellodlingssystem. Emerging 3D kulturtekniker tillåter generering av vävnadsliknande organoids från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). In vitro differentiering av pluripotenta stamceller i en 3D-suspensionskultur medger bildning av olika celltyper i tid och region-specifikt sätt, vilket ger upphov till en organiserad, skiktad vävnad ^{1, 2, 3.} Tack vare laboratorier som banade väg 3D odlingstekniker och avmystifierad komplexiteten av organbildning, med utgångspunkt från stamceller,vi utvecklat en robust metod för att generera hjärn organoids att avgränsa tidiga händelser av mänsklig hjärnans utveckling och att modellera mikrocefali in vitro ^{1, 2, 3.} Det är anmärkningsvärt att vi anpassat den ursprungliga metod som utvecklats av Lancaster et al. att generera cerebrala organoids ^1. Denna metod modifierades enligt våra experimentella krav.

Syftet med en studie från Gabriel et al. var att analysera de cellulära och molekylära mekanismer för neural stamcell underhåll under hjärnans utveckling. För att göra detta genomfördes en mekanistisk studie utförd genom att analysera neurala progenitorceller (NPC) i 3D hjärn organoids härledda från en mikrocefali patienten ^4. Denna patient genom en mutation i CPAP, en konserverad centrosomal protein som krävs för centrosom biogenes ^5. En allmänt accepterad hypotes är att mikrocefali är resultatet av en utarmning av NPC pool, och detta kan bero antingen på celldöd eller till för tidig differentiering ^{1, 6, 7, 8, 9.}

Genom att analysera de ventrikulära zoner (VZs) av mikrocefali hjärn organoids, visades det att ett betydande antal NPC genomgå asymmetrisk celldelning, till skillnad från hjärn organoids härledda från en frisk givare ^4. Omfattande mikroskopiska och biokemiska analyser av microcephalic hjärn organoids avslöjade en oväntad roll för CPAP i rätt tid cilier demontering ^4. Specifikt, är muterad CPAP associerad med retarderad cilium demontering och fördröjd cellcykel återinträde, vilket leder till för tidig differentiering av NPC ^4. Dessa resultat tyder på en roll för cilier i mikrocefali och thEIR engagemang under neurogenes och hjärnstorlek kontroll ^10.

Den första delen av detta protokoll är en beskrivning av en trestegsmetod för att generera homogena hjärn organoids. Som tidigare nämnts, var den ursprungliga Lancaster protokollet anpassas och modifieras för att passa vårt syfte ^en. Först, mänskliga iPSCs odlas i ett definierat matare fritt tillstånd på Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matris. Detta steg undviker variationer av matarberoende pluripotenta stamcellkulturer. I detta protokoll för att induktion av neural differentiering bilda neural epitel börjar direkt från iPSCs. Genom att hoppa över embryoid kropp (EB) bildningssteget, de neurala differentieringsfortskrider i en mer kontrollerad och riktad sätt. Detta tillvägagångssätt begränsar spontan och oriktade bildandet av andra könscellsskikt, såsom mesoderm och endoderm. Genom att tillämpa detta protokoll, kan neurosfärer som innehåller neurala rosetter skördas på dag 5 för EHS matris inbäddning och stationär suspensionsodling. Den organoid medium som används för det tredje steget i våra protokoll kompletteras med dorsomorphin och SB431542. Dorsomorphin är en liten-molekyl hämmare av benmorfogent protein (BMP), och SB431542 hämmar TGFp / aktivin / nodal signalväg. Kombinationen av dessa faktorer skulle kunna främja neural differentiering mer effektivt än retinsyra ensam ^{11, 12, 13, 14.}

Helt och hållet, dessa modifieringar möjliggöra reproducerbar alstring av hjärn organoids, med minimala variationer mellan organoids. Viktigare, var detta förfarande appliceras på robust generera microcephalic hjärn organoids från patientens iPSCs, som bär mutationer i gener som påverkar centrosomer och cellcykel dynamik.

Den andra delen av detta protokoll ger instruktioner för att förbereda brain organoids för analys och tolkning av cellulära defekter i mikrocefali. Detta inkluderar fixering, cryosectioning, immunofluorescerande färgning, och konfokal mikroskopanalys. Detta protokoll kommer att ge läsaren en detaljerad beskrivning av de förväntade resultaten och vägledning för tolkning.

Protocol

1. Generering av Brain Organoids (23 dagar) Inledande av neuroektoderm (5 dagar) OBS: Följande punkter bör beaktas innan differentiering. Omprogrammering metoden (lentiviral-, sendai-virus-, episomal- eller microRNA baserade etc.) för att erhålla humana iPSCs bör helst vara densamma för alla patienter och styra IPSC linjer. Olika omprogrammering kit och instruktioner baserade på publicerade protokoll finns 15, 16…

Representative Results

Genereringen av hjärn organoids kräver minst tre veckors kontinuerlig odling (Figur 1A). För att åstadkomma reproducerbara resultat rekommenderar vi att forskaren dokumenterar varje steg och, viktigare, undviker alla ändringar avseende medelkomponenter, tidpunkter och hanteringscellen. Här ger vi en sammanfattning av hur man ska värdera om kritiska milstolpar uppnås i syfte att erhålla organoids av tillräcklig kvalitet vid slutet av experimentet. Bildandet av n…

Discussion

MCPH är en komplex human neuroutvecklingsstörning som inte kan rekapituleras i djurmodeller in vivo eller i en enkel human cellkultur närmar in vitro. Den kliniska manifestationen av MCPH börjar dyka upp under den första trimestern, när tidig neurogenes börjar. Således 3D hjärn organoids representerar ett pålitligt experimentellt system för att modellera MCPH utveckling. Dessutom 3D mänsklig hjärn organoids är ett idealiskt tillvägagångssätt eftersom i) de tillåter för anpassning av …

Materials

Anti-mouse 488	Invitrogen	A-11001	Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488
Anti-rabbit 647	Invitrogen	A-21245	Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647
Arl13b	proteintech	17711-1-AP	ARL13B rabbit polyclonal antibody
CELLSPIN system	IBS Integra Bioscience	183001
DAPI	Sigma-Aldrich, US	32670	4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers
DMEM/F-12	Gibco, US	31331093	Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich, US	P5499	Compound C; multiple suppliers
Embedding medium	AppliChem	A9011, 0100	Mowiol; embedding medium; multiple suppliers
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix	Corning	354277	Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified
Fish gelatin	Sigma-Aldrich, US	G7765-250ML	Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C
Glycine	AppliChem	A1067,1000	Glycine for molecular biology; multiple suppliers
Inoculation loop with needle, disposable (1 µl)	Sigma Aldrich, US	BR452201-1000EA	multiple suppliers
Insulin	Sigma-Aldrich, US	I3536-100MG	multiple suppliers
L-glutamine	Gibco, US	25030081	L-glutamine (200 mM)
Medium A	Stem cell technologies	#05850	mTeSR1 (hiPSC medium)
Medium B	Stem cell technologies	#05835	Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium
Medium C	Gibco, US	21103049	Neural Basal Medium
MEM	Gibco, US	11140035	MEM non-essential amino acids solution (100x)
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza, Switzerland	#LT07-218	Mycoplasma detection kit; multiple suppliers
Nestin	Novus biologicals	NBP1-92717	Nestin mouse monoclonal antibody (4D11)
Paraformaldehyde (PFA)	AppliChem	A3813, 0500	4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood
PBS tablets	Gibco, US	18912014	See manufacturer´s instructions; multiple suppliers
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco, US	15140122	Multiple suppliers
Poly-L-lysine solution (PLL)	Sigma-Aldrich, US	P8920-100ML	Multiple suppliers
pVim	MBL	D076-3S	Phospho-Vimentin (Ser55) mAb
Reagent A	Stem cell technologies	# 05872	Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available
Reagent B	Sigma-Aldrich, US	A6964-100ML	Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution”
Research Cryostat Leica CM3050 S	Leica biosystems	CM3050 S	Multiple suppliers
SB431542	Selleckchem.com	S1067	Multiple suppliers
Spinner flask 250 ml	IBS Integra Bioscience	182026
Sucrose	AppliChem	A4734, 1000	Multiple suppliers
Superfrost ultra plus microscope slides	Thermo scientific, US	J3800AMNZ	Slides should be labeled with a "+" and positively charged
Supplement 1	Gibco, US	17502048	N-2 supplement (100x)
Supplement 2 w/o Vitamin A	Gibco, US	12587010	B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, NL	4565	Multiple suppliers
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura, NL	4583	Multiple suppliers
Triton X-100	AppliChem	A1388,0500	Multiple suppliers multiple suppliers
TUJ1	Sigma-Aldrich, US	T2200	β-Tubulin III (rabbit polyclonal)
TUNEL assay	Promega, US	G3250	DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers
Tween 20 for molecular biology	AppliChem	A4974,0500	Multiple suppliers
waterproof sheet	BEMIS company, inc.	PM996	Parafilm “M”; multiple suppliers
Y-27632	Selleckchem.com	S1049	ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers
β-mercaptoethanol	Gibco, US	31350010	2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers