Visualisere angiogenese af Multiphoton mikroskopi In Vivo i genetisk modificerede 3D-PLGA/nHAp stillads til Calvarial kritiske knogle defekt reparation
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at visualisere blodkar dannelse i vivo og i realtid i 3D stilladser af multiphoton mikroskopi. Angiogenese i genetisk modificerede stilladser blev studeret i en murine calvarial kritiske knogle defekt model. Flere nye blodkar blev opdaget i gruppen behandling end kontrol.
Abstract
Genopbygningen af kritisk størrelse knogledefekter forbliver en alvorlig klinisk problem på grund af dårlig angiogenese inden for væv-manipuleret stilladser under reparation, som giver anledning til en manglende tilstrækkelig blodforsyning og forårsager nekrose af nyt væv. Hurtig vascularization er en afgørende forudsætning for nye væv overlevelse og integration med eksisterende værten væv. De novo generation af Vaskulaturen i stilladser er et af de vigtigste skridt i at gøre knogle regenerering mere effektivt, giver mulighed for reparation væv til at vokse ind i et stillads. For at tackle dette problem, er den genetiske modifikation af en biomateriale stillads anvendes til at fremskynde angiogenese og osteogenesis. Men, visualisere og spore i vivo blodkar dannelse i realtid og i tre-dimensionelle (3D) stilladser eller nyt knoglevæv er stadig en hindring for knogle vævsmanipulering. Multiphoton mikroskopi (MPM) er en roman bio-imaging modalitet, der kan erhverve volumetriske data fra biologiske strukturer i en høj opløsning og minimalt invasiv måde. Formålet med denne undersøgelse var at visualisere angiogenese med multiphoton mikroskopi i vivo i en genetisk modificerede 3D-PLGA/nHAp stillads til calvarial kritiske knogle defekt reparation. PLGA/nHAp stilladser blev functionalized for vedvarende levering af en vækstfaktor pdgf-b genet bærer lentiviral vektorer (LV –pdgfb) for at lette angiogenese og forbedre knogle regenerering. I et stillads-implanteret calvarial kritiske knogle defekt musemodel, blodkar områder (BVAs) i PHp stilladser var betydeligt højere end i PH stilladser. Derudover steg udtryk af pdgf-b og angiogenese-relaterede gener, vWF og VEGFR2, tilsvarende. MicroCT analyse viste, at den nye knogledannelse i gruppen PHp dramatisk forbedret sammenlignet med de andre grupper. Til vores viden er det første gang multiphoton mikroskopi blev brugt i knoglen vævsmanipulering for at undersøge angiogenese i en 3D bio-nedbrydelige stillads i vivo og i realtid.
Introduction
Bone er en yderst vaskulariserede væv, der fortsætter med at remodel i løbet af en enkelt1. Hurtig og effektiv knogle regenerering af store knogledefekter som følge af traumer, ophelet, tumor resektion eller kraniofaciale misdannelser er et komplekst fysiologisk proces. Traditionelle terapeutiske metoder anvendes til knogle defekt reparation omfatter autograft og allograft implantation, men deres anvendelse indebærer flere problemer og begrænsninger, såsom begrænset tilgængelighed, væsentlig donor site sygelighed, en høj risiko for infektion, og vært immun afvisning2,3. Men kunstig knogle vin tilbyder et effektivt alternativ til at afhjælpe disse begrænsninger. De kan være fremstillet af bionedbrydelige materialer, er let at fremstille med en egnet porestørrelse og kan være genetisk modificerede4,5.
I øjeblikket har forskellige tissue engineering stilladser været ansat i udviklingen af væv-manipuleret knogle6,7. For at fremkalde knogle reparation og regeneration mere effektivt, har manipuleret biomaterialer kombineret med vækstfaktorer opstået og opnåede gode resultater8,9. Desværre begrænse kort halveringstid, let at miste aktivitet og suprafysiologiske dosering af vækstfaktorer for terapeutisk virkning deres kliniske anvendelse10. For at overvinde disse problemer, har levering af vækstfaktor gener i stedet for vækstfaktorer vist sig som en effektiv metode til at fastholde bioactivity til behandling af ossøse defekter og sygdomme11,12. Virale vektorer er lovende levering værktøjer til vævsregeneration på grund af deres høje udtrykker effektivitet13.
Blandt vækstfaktorer, blev Trombocyt-afledt vækst faktor (PDGF-BB) valgt i denne undersøgelse, fordi det er ikke kun en mitogen og chemoattractant for mesenchymale og osteogenic celler, men også en stimulans for angiogenese14,15 . Tidligere prækliniske og kliniske undersøgelser viste, at PDGF BB kunne sikkert og effektivt fremme bone reparation i parodontale ossøse defekter16,17. Nylige undersøgelser afslørede, at PDGF BB stimulerer angiogenese af motiverende endotel celle migration og spredning i vivo18,19. Derudover kan PDGF BB også gengive mesenchymale stamceller (msc) i stand til at differentiere i endothelial celler20, og denne yderligere højdepunkter MSCs potentielle rolle i neovascularization. Inducerende de novo dannelsen af Vaskulaturen i stilladser med PDGF BB er derfor et vigtigt skridt for reparation af væv vokset til stilladser i knoglen vævsmanipulering.
Defekt knogleheling er en dynamisk væv morfogenetiske proces, som kræver koordineret osteogenesis og angiogenese på reparation positioner21. Neoangiogenesis i implanterede væv-manipuleret stilladser er en afgørende forudsætning for at levere celler med næringsstoffer og ilt til vækst og overlevelse og til fjernelse af metaboliske affald. Almindeligt anvendt imaging metoder, beregnet herunder X-ray mikro-tomografi (microCT), magnetisk resonans imaging (MR), scanning elektronmikroskopi (SEM), optisk kohærens tomografi (OCT) og konfokal laser scanning mikroskopi, anvendes i stedet for Histologisk undersøgelse at opnå angiogenese oplysninger22,23. Disse metoder står imidlertid over forskellige forhindringer i visualisering og måling af neovasculature i 3D stilladser i knoglen vævsmanipulering. Multiphoton mikroskopi (MPM) er en forholdsvis ny bio-imaging teknik, der har særskilte fordelen ved samtidig visualisere celler, ekstracellulære matrix, og de omkringliggende vaskulære netværk in vivo. Det har en iboende tredimensional billeddannelse evne til dybe væv penetration og forårsager lav solskader. Derfor, i det sidste årti, MPM har fået meget opmærksomhed i biomedicinsk undersøgelser24, herunder i neurovidenskab, immunologi og stamceller dynamik. Dog er det næppe anvendes i ortopædiske forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bone er en yderst vaskulariserede væv med en enestående kapacitet til løbende at helbrede og remodel i hele levetiden for en individuel1. Vascularization er vigtigt for osteogenesis og defekt reparation. Lav vascularization begrænser bred klinisk anvendelse af væv-manipuleret knogle. Konstruere en yderst vaskulariserede væv-manipuleret knogle ifølge teorien om Biomimetik er blevet et værktøj til at reparere store segment knogledefekter. Forskellige former for stilladser har været anvendt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Shenzhen Peacock Program, Kina (nr. 110811003586331), Shenzhen grundlæggende Research Program (nr. JCYJ20150401150223631, nr. JCYJ20150401145529020 og nr. JCYJ20160331190714896), Guangdong offentlig forskning og kapacitetsopbygning særlige programmet (nr. 2015A020212030), National Natural Science Foundation i Kina (nr. 81501893), den nationale Major Basic Research Program af Kina (2013CB945503), og den SIAT Innovation Program til fremragende yngre forskere (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
Referências
- Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
- Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
- Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
- Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
- Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
- Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
- Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
- Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
- Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
- Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
- Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
- Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
- Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
- Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
- Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
- Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
- Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
- Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
- Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
- Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
- Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
- Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
- Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
- Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
- Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348 (2011).
- Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
- Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
- Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
- Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
- Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
- Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
- Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
- Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
- Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4 (2015).
- Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
- Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
- Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
- Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
- Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
- Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).
