Visualizando a angiogênese por Multiphoton microscopia In Vivo no andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para raspagem crítico reparo de defeito ósseo
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar vasos sanguíneos formação em vivo e em tempo real em 3D andaimes por microscopia do multiphoton. Angiogênese em andaimes geneticamente modificados foi estudado em modelo murino raspagem de osso crítico defeito. Mais novos vasos sanguíneos foram detectados no grupo de tratamento do que em controles.
Abstract
A reconstrução de defeitos ósseos criticamente tamanho permanece um problema clínico sério por causa do pobre angiogênese dentro engenharia de tecido andaimes durante o reparo, que dá origem a uma falta de oferta suficiente de sangue e provoca necrose dos tecidos novos. Rápida vascularização é um pré-requisito vital para a sobrevivência de tecido novo e integração com o tecido do hospedeiro existente. A geração de novo da vasculatura em andaimes é um dos passos mais importantes na tomada de regeneração óssea mais eficiente, permitindo a reparação do tecido a crescer em um andaime. Para resolver este problema, a modificação genética de um andaime de biomaterial é usada para acelerar a angiogênese e osteogênese. No entanto, visualização e acompanhamento na vivo formação de vasos sanguíneos em tempo real e em três dimensões (3D) andaimes ou novo tecido ósseo ainda é um obstáculo para a engenharia de tecido ósseo. Microscopia do multiphoton (MPM) é uma modalidade de bio-imagem romance que pode adquirir dados volumétricos de estruturas biológicas de forma minimamente invasivos e de alta resolução. O objetivo deste estudo foi Visualizar angiogênese com microscopia do multiphoton na vivo em um andaime de 3D-PLGA/nhập geneticamente modificado para reparo de defeito de fragmento ósseo crítico. Andaimes PLGA/nhập foram acrescidas para a entrega sustentada de um gene de factor de crescimento pdgf-b carregando Lentivirus vetores (LV –pdgfb) para facilitar a angiogênese e aumentar a regeneração óssea. Em um andaime implantados raspagem osso crítico defeito modelo do rato, as áreas de vaso sanguíneo (BVAs) em PHp andaimes foram significativamente maiores do que em PH andaimes. Além disso, a expressão de pdgf-b e genes relacionados com angiogênese, vWF e VEGFR2, aumentado correspondentemente. MicroCT análises indicaram que a formação de osso novo no grupo PHp dramàtica melhorado em comparação com os outros grupos. A nosso conhecimento, esta é a primeira vez que microscopia do multiphoton foi usada em engenharia de tecidos ósseo para investigar a angiogênese em um andaime biodegradável 3D em vivo e em tempo real.
Introduction
Osso é um tecido altamente vascularizado que continua a remodelar-se durante o tempo de vida de um indivíduo1. A regeneração óssea rápida e eficaz de defeitos de osso grande resultantes de trauma, pseudartrose, ressecções tumor ou malformações craniofaciais é um processo fisiológico complexo. Abordagens terapêuticas tradicionais utilizadas para reparo de defeito ósseo incluem implantação autograft e aloenxerto, mas sua utilização envolve vários problemas e limitações, como disponibilidade limitada, morbidez do local doador significativo, um alto risco de infecção, e Hospede de2,de rejeição imune3. No entanto, enxertos ósseos artificiais oferecem uma alternativa eficiente para aliviar essas limitações. Eles podem ser feitos de materiais biodegradáveis, são fáceis de ser fabricar com um tamanho de poro adequado e podem ser geneticamente modificados4,5.
Atualmente, vários andaimes de engenharia de tecidos têm sido empregadas no desenvolvimento da engenharia de tecido ósseo6,7. Para induzir a regeneração e reparação óssea mais eficazmente, engenharia biomateriais combinados com fatores de crescimento têm emergiu e alcançado bons resultados8,9. Infelizmente, a meia-vida curta, fácil-à-perder atividade e suprafisiológicas dosagem de fatores de crescimento para eficácia terapêutica limitam sua aplicação clínica10. Para superar estes problemas, demonstrou-se a entrega de genes de fator de crescimento, em vez de fatores de crescimento como uma abordagem eficaz para sustentar a bioatividade para o tratamento de defeitos ósseos e doenças11,12. Vetores virais são promissor entrega ferramentas para regeneração tecidual devido a sua alta eficiência13de expressar.
Entre os fatores de crescimento, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-BB) foi selecionada neste estudo porque é não só um mitógeno e quimiotático para células mesenquimais e osteogênicas, mas também um estimulante para a angiogénese14,15 . Estudos pré-clínicos e clínicos anteriores mostraram que PDGF-BB poderia com segurança e eficazmente promover reparação óssea em defeitos ósseos periodontais16,17. Estudos recentes revelaram que o PDGF-BB estimula angiogênese por motivação endothelial da pilha da proliferação e migração na vivo18,19. Além disso, PDGF-BB também pode processar as células-tronco mesenquimais (MSCs) capazes de se diferenciar em células endoteliais20e este mais destaca o papel potencial do MSCs na neovascularização. Portanto, induzindo a formação de novo da vasculatura em andaimes com PDGF-BB é um passo importante para a reparação do tecido crescido em andaimes em engenharia de tecido ósseo.
Defeito de consolidação é um processo morfogenético tecido dinâmico que requer coordenada osteogênese e angiogênese na reparação posições21. Neoangiogênese em andaimes engenharia de tecido implantados é um pré-requisito essencial para o fornecimento de células com nutrientes e oxigênio para o crescimento e sobrevivência e para a remoção de resíduos metabólicos. Comumente usado métodos de imagem, incluindo raios x micro computado-tomografia computadorizada (microCT), ressonância magnética (MRI), microscopia eletrônica de varredura (MEV), a tomografia de coerência óptica (OCT) e laser confocal, microscopia, são aplicados em vez de exame histológico para obter informações de angiogênese22,23. No entanto, estes métodos de enfrentam vários obstáculos em Visualizar e medir a neovasculature em 3D andaimes em engenharia de tecido ósseo. Microscopia do multiphoton (MPM) é uma técnica de bio-imagem relativamente nova que tem a vantagem distinta de simultaneamente Visualizar células, matriz extracelular e em torno de redes vasculares in vivo. Possui uma capacidade inerente de imagem tridimensional para penetração profunda do tecido e provoca baixo Fotodano. Daí, na última década, MPM tem ganhado muita atenção em estudos biomédicos24, incluindo em neurociência, imunologia e dinâmica de células-tronco. No entanto, quase não é usado em investigação ortopédica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osso é um tecido altamente vascularizado, com uma capacidade única de curar e remodelar durante toda a vida de um indivíduo1continuamente. O nível da vascularização é importante para o reparo de osteogênese e defeito. Baixa vascularização limita a aplicação clínica ampla da engenharia de tecido ósseo. Construir um osso altamente vascularizado engenharia de tecidos, de acordo com a teoria da biomimética, tornou-se uma ferramenta para a reparação de defeitos ósseos de segmento gran…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi suportado pelo programa pavão Shenzhen, China (n. º 110811003586331), programa de pesquisa básica Shenzhen (n. º JCYJ20150401150223631, n. º JCYJ20150401145529020 e não. JCYJ20160331190714896), a Guangdong público pesquisa e capacitação programa especial (n º 2015A020212030), a Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81501893), o programa de pesquisa de Basic Major nacional da China (2013CB945503) e o Programa de inovação SIAT para excelentes jovens investigadores (Y5G010).
Materials
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Sigma | P1941 | L/G ratio 75:25, MW 66000-107000 |
| Hydroxyapatite nanoparticles | Sigma | 702153 | Average diameter < 200nm |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma | C6628 | |
| FITC-conjugated 250-kD dextran | Sigma | FD250S | |
| 1,4-dioxane | lingfeng,Shanghai | 0.45 micron | |
| Stericup filters | Merck Millipore Corporation | SLHV033RB | |
| PDGF-BB Cdna | Sino Biological, Inc | MZ50801-G | |
| Anti-PDGF-BB mouse polyclonal antibody | BioVision, Inc | 5489-30T | |
| PDGF-BB recombinant protein | 4489-50 | ||
| Calcium-phosphate transfection solution | Promega Corporation | E1200 | |
| L-DMEM | Hyclone | SH30021.01 | |
| DPBS | Hyclone | SH30028.01 | |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10099-141 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| Male BALB/c mice | Guangdong Medical Laboratory Animal Center | ||
| sodium pentobarbital | Merck | 1063180500 | |
| multiphoton microscopy | A homemade in Shenzhen Institutes of Advanced Technology to detect two-photon excited fluorescence (TPEF) and second harmonic generation signal (SHG). | ||
| isoflurane | Keyuan, Shandong | 401750169 | |
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | Takara | RR420B | |
| SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR036B | |
| Hematoxylin and eosin | Beyotime | C0105 | |
| Paraffin | Leica | RM2235 | |
| Ultracentrifuge OPtima L-100XP | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Low-temperature printer | Tsinghua university | A homemade in Tsinghua university | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5815916001 | |
| microCT | Bruker | 1176 | |
| commercial software | Bruker |
Referências
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