Oppdagelse og berikelse av Rare antigen-spesifikke B-celler for analyse av fenotype og funksjon
Summary
En enkel, men effektiv metode som benytter magnetiske nanopartikler å oppdage og berike antigen-reaktive B-celler for funksjonell og fenotypeanalyser er beskrevet.
Abstract
B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of <0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.
Introduction
Begrensende fortynning analyser av antistoff-utskillende celle forløper frekvens har foreslått at B-celler som er reaktive til et spesielt antigen vanligvis forekommer ved en frekvens på 0,05 til 0,005% i den normale repertoaret, avhengig av vaksinasjonsstatus og størrelse / antall epitoper som er tilstede på antigenet. Den lave frekvens av disse celler har gjort det vanskelig å studere forandringer i deres status i løpet av utviklingen av immunresponser, så som etter vaksinasjon eller eksponering for et fremmed antigen, eller i løpet av utviklingen av autoimmunitet. Tidligere forskere har foretatt isolering av antigen-reaktive B-celler ved anvendelse av teknikker som varierer fra antigen-belagte plater eller kolonne adsorbenter, til antigen-belagte røde blodlegemer tilbakestilling, til fluorescens-aktivert cellesortering 1, 2, 3, 4, 5, 6. though disse teknikkene har vært vellykket i å identifisere og isolere antigen-reaktive B-celler, har resultatene variert i form av utbytte, renhet og skalerbarhet. Nylig har vi utviklet en ny metode for å både oppdage og berike sjeldne B lymfocytsubpopulasjoner ved hjelp av magnetiske nanopartikler. Fremgangsmåten gjør det mulig anrikning med relativt høyt utbytte og renhet fra store utgangs populasjoner, og er kompatibel med analyse av responser til antigen. Ved å anrike fra populasjoner av celler i suspensjon, eliminerer fremgangsmåten begrensninger som er knyttet til geometrien av antigen-belagte plater eller kolonner, og begrense gjennomstrømningen. Til slutt, siden anrikede celler forbli assosiert med antigen og et fluorescerende reporter, kan de renses ytterligere ved FACS sortering. Som beskrevet her er det brukt denne tilnærmingen for studier av perifere blod tetanustoksoid-reaktive B-celler før og etter immunisering av mennesker, så vel som autoantigen-reaktive B-celler fra individer med forskjellige autoimmune lidelser, inkludert type 1 diabetes, Graves 'sykdom, og Hashimotos sykdom 7. Metoden fungerer like bra i mus og menneske, og er kompatibel med analyse av antigen-reaktive B-celler fra forskjellige vev (manuskript under forberedelse).
I sin grunnleggende format, perifert blod mononukleære celler først inkubert med biotinylert antigen sammen med antistoffer til celleoverflateantigener som kreves for fenotypisk analyse. Denne merking trinnet er etterfulgt av vasking og fiksering, og tilsetning av streptavidin koblet til langt-rød-fluorescerende fargestoff for deteksjon av de biotinylerte-antigenbindende-celler (figur 1). Tidligere studier har identifisert antigen-spesifikke B-celler på en lignende måte, men ved bruk av antigenene direkte konjugert til et fluorokrom 8, 9, 10, 11. Selv om dette er en verdigtilnærming, bruk av biotinylerte antigener i forbindelse med streptavidin muliggjør større signalforsterkning (og dermed bedre differensiering av bindende og ikke-bindende celler), særlig når antigenene er liten, 12, 13, 14. En ytterligere betraktning er bruken av streptavidin i stedet for avidin fordi streptavidin er deglykosylert, redusere ikke-spesifikk binding. Videre bruker vi langt-rød-fluorescerende fargestoff som fluorokrom på grunn av sin fotostabilitet, kvanteutbytte (lysstyrke), og dens lille størrelse (~ 1,3 kD). Protein fluorokromer slik som fykoerytrin (~ 250 kD) og allofykocyanin (~ 105 kD) 15 er ikke optimal fordi de potensielt inneholder flere antigene epitoper. Anvendelse av et lite organisk fluorescerende fargestoff som består av en enkel epitop, slik som langt-rød-fluorescerende fargestoff, reduserer kompleksiteten av den isolerte cellepopulasjon.
Når cellene er biotinylert-enntigen og vidt rød-fluorescerende fargestoff-streptavidin adsorbert, er de beriket bruker anti-langt-rød-fluorescerende fargestoff-konjugert magnetiske nanopartikler. Enkeltnanopartikler er ikke oppdaget av de fleste flowcytometere og derfor trenger ikke fjernes før rensing ved FACS sortering og nedstrøms analyser 16. Magnetisk utvalg for antigen-spesifikke B-celler beriker bestanden av interesse, eliminere tiden og kostnadene for sortering sjeldne hendelser ved hjelp av et flowcytometer.
Nedenfor viser vi representative resultater fra anriking av tetanus-toksoid-spesifikke B-celler fra et emne før og syv dager etter tetanustoksoid booster vaksinasjon. Vi valgte denne spesielle anvendelse som et eksempel for å demonstrere evnen som denne fremgangsmåten for å anrike antigen-spesifikke B-celler etter akutt in vivo stimulering. Når dette kombineres med strømningscytometri, er denne metoden i stand til å berikende og differensierende antigen-spesifikke naive, hukommelse, ogplasmablast B-celler og tillater forskeren å følge endringer i frekvens over tid. I tillegg, inkluderer vi en annen mulig nedstrøms assay, for eksempel en ELISPOT-analyse, som viser at celler som beholder evnen til å utskille antistoff etter anrikning. En annen anvendelse av denne fremgangsmåte kan omfatte adoptiv overføring av anriket celler i en vert. Vi har tidligere vist celler opprettholde evnen til å virke som antigenpresenterende celler til antigen-spesifikke T-celler etter isolering og overføring (data ikke vist). Derfor er det et antall mulige nedstrøms analyser som kan bli koplet til den metode som sammen informerer forståelsen av den antigen-spesifikke immunrespons. Vi har beskrevet metoden nedenfor, inkludert kontroller for å fastslå samlede utbyttet, renhet, celle spesifisitet, og fold-berikelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en ny fremgangsmåte for å oppnå isolering og anrikning av antigen-bindende B-celler fra humant perifert blod. Fremgangsmåten er lett anvendelig for mus og andre vev, slik som milt og lymfeknuter, og er kompatibel med etteranrikning analyse av celle-fenotype og funksjon (manuskript under forberedelse).
Brukeren bør være bevisst på en rekke variabler som kan påvirke suksessen av denne prosedyren. Av erfaring døde celler har en tendens til å holde seg til de magnetisk…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) and the National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201, and F30OD021477).
Materials
| Antigen of interest | variable | variable | At least 100 μg to biotinylate easily; if using protein try to use protein that has been validated by ELISA. It must be carrier protein free. |
| Biotin for labeling; e.g. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | e.g. Thermo Scientific | e.g. 21335 | Biotin is available in different formulations, such as those containing various length spacers, so the type used should be determined by the researcher |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Can obtain from other suppliers. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Microbeads | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MACS manual separators | Miltenyi Biotech | variable | |
| Formaldehyde | Dilute to 2% with PBS; optional if downstream assay requires live cells | ||
| PBS without calcium and magnesium | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Whole blood in heparinized collection tubes | |||
| FACS buffer (PBS + 1% BSA + 0.01% sodium azide) | |||
| Separation buffer (PBS + 0.5% BSA + 2mM EDTA) | |||
| 50 mL conical tubes | |||
| 15 mL conical tubes | |||
| 1.5 mL Eppendorf tubes | |||
| Surface marker reactive antibodies, Fc Block, live/dead discriminating stain, if needed | |||
| ELISPOT supplies, if needed |
Referências
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
- Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
- Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
- Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
- Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
- Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
- Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
- Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
- Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
- Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
- Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
- Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
- Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
- Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
- Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).
