Langvarig Inkubation af akut neuronalt væv for Elektrofysiologi og Calcium-billeddannelse

Summary

Når fjernes fra kroppen, er neuronalt væv stærkt påvirket af miljømæssige forhold, der fører til eventuel nedbrydning af vævet efter 6 – 8 timer. Ved hjælp af en unik inkubation fremgangsmåde, som nøje overvåger og regulerer det ekstracellulære miljø af vævet, kan vævslevedygtighed blive udvidet betydeligt i> 24 timer.

Abstract

Akut neuronale væv præparater, hjerne skiver og retinal wholemount, kan normalt kun opretholdes i 6 – 8 timer efter dissektion. Dette begrænser den eksperimentelle tid, og øger antallet af dyr, der er brugt per undersøgelse. Denne begrænsning specifikt påvirkninger protokoller såsom calcium imaging, der kræver langvarig præ-inkubering med bad-anvendte farvestoffer. Eksponentiel bakterievækst inden for 3 – 4 timer efter slicing tæt korreleret med et fald i væv sundhed. Denne undersøgelse beskriver en fremgangsmåde til at begrænse antallet af bakterier i akutte præparater for at opretholde levedygtige nervevæv i længere tid (> 24 h) uden behov for antibiotika, sterile procedurer, eller vævskultur medier indeholdende vækstfaktorer. Ved at cykle den ekstracellulære væske gennem UV-bestråling og holde vævet i en brugerdefineret bedrift kammer ved 15 – 16 ° C vævet viser ingen forskel i elektrofysiologiske egenskaber eller calcium signaling gennem intracellulære calcium farvestoffer ved> 24 timer postdissection. Disse metoder vil ikke kun forlænge eksperimentel tid for dem ved hjælp akut nervevæv, men vil reducere antallet af dyr, der kræves for at fuldføre eksperimentelle mål, og vil sætte en guld standard for akut neuronalt væv inkubation.

Introduction

Elektrofysiologi og funktionel billeddannelse (calcium, spænding følsomme farvestoffer) er to af de mest almindeligt anvendte eksperimentelle teknikker i Neuroscience. Brain slice præparater og retinal wholemount, som vil blive behandlet her, er et middel til at undersøge elektrofysiologiske egenskaber og synaptisk konnektivitet uden forurening fra anæstetika eller muskelrelaksantia. Hjerneskiver og retinal wholemount bevare deres strukturelle integritet, i modsætning kulturer eller cellehomogenater, tillader undersøgelsen af særlige kredsløb og hjernenetværk ^1. Optagelser fra isolerede væv har fordele i forhold til in vivo optagelser, da bevægelser forbundet med hjerteslag og respiration er elimineret. Desuden direkte visualisering giver specifikke klasser af celler, der skal målrettet og lokal anvendelse af farmakologiske værktøjer ^{2, 3.}

Patch-clamp optagelser og calcium farvestof-belastning i retinal wholemount kompliceres af eksistensen af ​​Inner Begrænsning Membrane (ILM), som dækker Retinal ganglieceller (RGC) lag og forhindrer direkte adgang til cellerne. Typisk er denne membran skrabes væk med en glaspipette til at tillade direkte anvendelse af et plaster pipette og dannelse af en gigaohm forseglingen på en enkelt celle. Hertil kommer, at bad påført calcium farvestoffer ikke krydse ILM og skal enten injiceres under denne membran ^4, retrogradt transporteres efter injektion på synsnerven ⁵ eller elektroporeret gennem vævet ^6. Endvidere, når anvendelse af en gnaver-model af retinitis pigmentosa, rd / rd mus, ILM er tykkere og mere uigennemtrængelig. Her bruger vi en teknik til at fjerne ILM med enzymatisk fordøjelse ^7, at give både allestedsnærværende calcium farvestof-belastning, og direkte adgang til retinale ganglieceller til patch-clamp RECORDINGS ^8.

Succesfulde optagelser fra enten hjernen skiver eller retinal wholemount afhænger dissektion og inkubering af levedygtigt neuronalt væv. Typisk væv ekstraheres om morgenen for eksperimentet og inkuberet i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), indtil det anvendes til optagelser. Normalt væv forbliver levedygtige i 6 – 8 timer, med betydelig nedbrydning følger denne tidsvindue. Men begge hjerneskiver og wholemount retinae præparater normalt producerer mere væv end der kan optages inde fra denne korte tidsperiode. Derfor bliver vævet ofte kasseret i slutningen af ​​dagen og dissektion afsluttes igen på de efterfølgende dage. Det betyder et andet dyr anvendes, og ~ 2 timers opsætning og dissektion / farvning gentaget. Følgende protokol beskriver en fremgangsmåde til at forlænge levetiden af ​​neuronvæv i mere end 24 timer, hvilket betyder færre dyr anvendes, og mere eksperimentelle tid til rådighed. Tissue levedygtighed wsom vurderet gennem optagelse af elektrofysiologiske egenskaber og calcium dynamik, og disse egenskaber var ikke skelnes mellem <4 timer og> 24 timer postdissection.

Disse resultater viser, at ikke alene er encellede egenskaber intakt og funktionel efter forlænget inkubation, men netværksaktivitet, som vurderet ved calcium-billedbehandling og elektrofysiologiske optagelser, er uændret> 24 timer postdissection. Endvidere viser vi, at calcium farvestoffer kan forblive i celler i længere perioder uden at forårsage nogen skadelige virkninger. Anvendelsen af ​​denne protokol viser, at den funktionelle aktivitet af neuroner i akut neuronal væv kan opretholdes i lange perioder, når det eksterne miljø er stærkt reguleret. Da levedygtighed væv varierer meget mellem laboratorier på grund af forskellige inkubation protokoller, denne metode etablerer en guld standard for de ideelle parametre, der skal anvendes til at reducere variation i sundhed akut neuronal væv.

Protocol

Protokollen nedenfor beskriver fremstillingen af ​​C57BL / 6 og C3H / He (retinally degenerere) mus neuronalt væv, men tilsvarende teknikker kan anvendes til andre arter. Alle dyr var sunde og håndteres med standardbetingelser for temperatur, fugtighed, 12 timers lys / mørke cyklus, fri adgang til mad og vand, og uden nogen bestemt stress stimuli. Alle forsøg blev godkendt og udført i overensstemmelse med vestlige Sydney University Animal Care og etik udvalg og i henhold til dyret brug og retningslinjer pleje (Animal Research Autho…

Representative Results

Tæt regulering af den bakterielle belastning og temperatur af aCSF under inkubation er vigtigt at opretholde neuronalt væv levedygtighed. Dette kan optimeres gennem bestråling med UVC lys og opretholdelse af temperaturen af aCSF ved 15 – 16 ° C (figur 1). Desuden aCSF parametre stempel (APS, figur 1C) giver forsøgslederen med en registrering af de miljømæssige forhold (pH og temp.), Hvilket giver en guld standard for parametre, når inkubere neuro…

Discussion

Denne artikel beskriver en inkubation metode til at forlænge holdbarheden af ​​akut neuronal væv til billedbehandling og elektrofysiologiske eksperimenter og dermed reducere de antallet af dyr, der er nødvendige for at gennemføre eksperimentelle mål. To vigtige processer regulerer forringelse af neuronal væv over tid: i) øget bakterier niveauer, og den ledsagende stigning i bakteriel endotoksin frigivet, og ii) excitotoksicitet som følger den traumatiske udskæring procedure ^10. Som a…

Materials

Sodium Chloride	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P9333
N-Methyl-D-glucamine	Sigma Aldrich	M2004
D-glucose	Sigma Aldrich	G5767
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S2554
Magnesium chloride	Sigma Aldrich	M9272
Calcium chloride	Sigma Aldrich	223506
Papain Dissociation System	Worthington	LK003150
Dimethyl sulfoxide anhydrous	Sigma Aldrich	276855
Pluronic F-127 Low UV absorbance*	Life technologies	P-6867	20% solution in DMSO
Fura-2 AM	Anaspec	84017
Fluo-4 AM	Life Technologies	F23917
Fluo-8 AM	Abcam	Ab142773
Vibrating blade microtome	Leica Biosystem	VT1200 S	Equiped with Leica’s Vibrocheck™ measurement device
Antivibration table	Kinetic Systems Vibraplane	Vibraplane 9100/9200
Fixed Stage Upright Microscope	Olympus	BX51WI
Microscope Objective	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20X
Microscope Objective	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60X
CCD Camera	Andor	Ixon +
High speed wavelength switcher	Sutter instrument	Lambda DG-4
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B
Data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A	Axon Digidata® System
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instrument Co	BF150-86-10
Microelectrode puller	Sutter Instrument Co	P-97	Flaming/Brown type micropipette puller
Recording/perfusion chamber	Warner Instruments	RC-40LP	Low Profile Open Bath Chambers
Software	Molecular Devices	pClamp 10.2
Andor iQ Live Cell Imaging Software	Andor	Andor iQ3
Braincubator	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Thermoelectric Cold Plate Cooler	TE Technology	CP-121
Temperature Controller	TE Technology	TC-36-25 RS232