ניתוח מורפולוגיה דנדריטים ב עמודות שכבות
Summary
כאן, אנו מראים כיצד לנתח ניתוב הדנדריטים של נוירונים לשד תסיסנית בעמודות ושכבות. זרימת העבודה כוללת טכניקת דימות כפול במטרה לשפר את איכות התמונה ואת בכלים חישוביים לאיתור, רישום סוכות דנדריטים למערך טור התייחסות לניתוח מבנים הדנדריטים בחלל 3D.
Abstract
באזורים רבים של מערכות עצבים המרכזיות, כגון אונות זבוב הראייה ואת קליפת החולייתנים, מעגלים הסינפטי מאורגנים בשכבות ועמודות כדי להקל חיווט המוח במהלך התפתחות ועיבוד מידע בחיות מפותחות. Postsynaptic נוירונים דנדריטים משוכללים בדפוסי סוג ספציפי בשכבות ספציפיות סינפסה עם מסופי presynaptic מתאימים. Neuropil לשד זבוב מורכב 10 שכבות וכ 750 עמודים; כל טור מעוצבבים על ידי דנדריטים של מעל 38 סוגים של נוירונים מוארכים, אשר תואמו עם מסופי axonal של כ -7 סוגים של afferents באופן סוג ספציפי. דו"ח זה מפרט את הנהלים תמונה ולנתח דנדריטים של נוירונים לשד. זרימת העבודה כוללת שלושה חלקים: (i) בסעיף ההדמיה הכפול-הנוף משלב שתי ערימות תמונת confocal שנאספו אורינטציות מאונכות לתמונת 3D ברזולוציה גבוהה של דנדריטים; (Ii) דנדריט התחקות וסעיף רישום עקבות הדנדריטיםסוכות ב 3D ורושמת עקבות הדנדריטים למערך טור הפניה; הסעיף (iii) בניתוח הדנדריטים מנתח דפוסי הדנדריטים ביחס עמודות ושכבות, כוללים סיום שכבה ספציפית והשלכה מישוריים לכיוון סוכת דנדריטים, ונובע הערכות של הסתעפות הדנדריטים ותדרי סיום. הפרוטוקולים לנצל plugins נבנה בהתאמה אישית על MIPAV הקוד הפתוח (עיבוד הדמיה רפואי, ניתוח, ויזואליזציה) ארגזי כלי פלטפורמה אישית בשפת מעבדת מטריקס. יחד, פרוטוקולים אלה מספקים עבודה מלאה לנתח את ניתוב הדנדריטים של נוירונים לשד תסיסנית בשכבות ועמודות, לזהות סוגי תאים, ולקבוע פגמים מוטציות.
Introduction
במהלך פיתוח, נוירונים דנדריטים משוכללים מורכבים אך שבלונות דפוסי קנים כדי ליצור סינפסות עם שותפי presynaptic שלהם. דפוסי הסתעפות דנדריטים לתאם עם זהות ופונקציות עצביות. המיקומים של סוכות דנדריטים לקבוע את סוג תשומות presynaptic שהם מקבלים, בעוד הדנדריטים הסתעפות גדלים מורכבי שדה למשול מספר הקלט. לפיכך, תכונות מורפולוגיות הדנדריטים הם גורמים קריטיים עבור קישוריות הסינפטי וחישוביות עצבית. באזורים רבים של מוחות מורכבים, כגון אונות האופטיות הזבוב לבין הרשתית החולייתנים, מעגלים הסינפטי מאורגנים בעמודות ושכבות כדי להקל מידע עיבוד 1, 2. בארגון טור שכבה כזה, נוירונים presynaptic של אקסונים פרויקט אפנות ברורים לסיים ב שכבה מסוימת (מה שנקרא מיקוד שכבה ספציפית) וליצור מערך דו ממדים מסודר (מה calleמפה טופוגרפית ד), ואילו נוירונים postsynaptic להאריך דנדריטים בגדלים המתאימים שכבות ספציפיות כדי לקבל תשומות presynaptic לגבי סוגם המספרים הנכונים. בעוד אקסונלית מיקוד לשכבות ועמודות כבר גם למדה 3, 4, הרבה פחות ידוע על כמה דנדריטים מנותבים שכבות מסוימות ולהרחיב בגודל מתאים שדות פתוחים כדי ליצור קשרים סינפטיים עם שותפי presynaptic הנכונים 5. הקושי של הדמיה וכימות הדנדריטים מיקוד לשכבות ועמודות עיכב את חקר התפתחות דנדריטים במבנים במוח כמו עמודים למינציה.
נוירונים לשד תסיסנית מהווים מודל אידיאלי ללימוד ניתוב הדנדריטים והרכבה מעגל בעמודות ושכבות. Neuropil לשד לטוס מאורגן כמו סריג 3D של 10 שכבות וכ 750 עמודות. כל טור מעוצבבים על ידי קבוצה של afferents, כולל photoreceptors R7 / R8 ו lamina נוירונים L1 – L5, אשר מסופי אקסונלית ליצור מפות טופוגרפיות באופן שכבה ספציפית 6. כ -38 סוגים של נוירונים לשד נוכחים בכל טור לשד דנדריטים משוכלל בשכבות ספציפיות עם גדלים בשדה מתאימים לקבל תשומות מן afferents אלה 7. המעגלים הסינפטי לשד שוחזרו ברמה מיקרוסקופית אלקטרונים; וכך, השותפויות הסינפטי מבוססות היטב 7, 8. יתר על כן, כלים גנטיים תיוג סוגים שונים של נוירונים לשד זמינים 9, 10, 11. על ידי בחינת שלושה סוגים של transmedulla (Tm) נוירונים (TM2, Tm9 ו Tm20), זיהינו בעבר שתי תכונות הדנדריטים תא מסוג ספציפי: (i) נוירונים Tm להקרין דנדריטים באחת בכיוון הקדמי או האחורי (proj מישורייםשיקוף כיוון), בהתאם לסוגי התאים (ii) דנדריטים של נוירונים לשד לסיים בשכבות לשד ספציפיות באופן תא מסוג ספציפי (סיום ספציפי שכבה) 12. כיוון היטל מישורים והפסקה ספציפי שכבה מספיק כדי לבדל את השלושה סוגי נוירונים TM, תוך מוטציות שמפריעות תגובות Tm לרמזי שכבה ו בעמודה משפיעות היבטים שונים של תכונות אלה.
כאן, אנו מציגים עבודה מלאה לבחינת דפוסים הדנדריטים של נוירונים לשד תסיסנית בעמודות ושכבות (איור 1). ראשית, אנו מציגים שיטת הדמיה כפול-נוף, אשר משתמשת תוכנה מותאמת אישית כדי לשלב שתי תמונת confocal ערימות ליצור תמונות איזוטרופיים באיכות גבוהה. שיטה זו דורשת מיקרוסקופ confocal הקונבנציונלי רק כדי ליצור תמונות באיכות גבוהה המאפשרות מעקב האמין של סניפים הדנדריטים, בלי להזדקק מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה, כזההים STED (דלדול פליטה מאולץ) או תאורה מבנית. שנית, אנו מציגים שיטה לאיתור סוכות דנדריטים לרישום עקבות neurite וכתוצאה מכך למגוון טור התייחסות. שלישית, אנו מציגים את השיטות חישוביות לחילוץ מידע על כיוון הקרנת מישוריים סיום ספציפי שכבת דנדריטים, כמו גם לגזירת אומדנים עבור הסתעפות הדנדריטים ותדרי סיום. יחד, כל אלה מאפשרים לאפיון דפוסי הדנדריטים ב -3 D, הסיווג של סוגי תאים מבוססים על מורפולוגיות הדנדריטים, ואת ההזדהות של פגמים פוטנציאליים מוטנטים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מראים כיצד התמונה ולנתח סוכות הדנדריטים של נוירונים לשד תסיסנית. החלק הראשון, ההדמיה הכפולה VOD, מתאר את deconvolution שילוב של שתי ערימות תמונה לתוך ערימת תמונה ברזולוציה גבוהה. החלק השני, מעקב דנדריט ורישום, מתאר את העקיבה ורישום דנדריטים של נוירונים לשד למערך…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר עירונית של המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, המכון הלאומי יוניס קנדי שרייבר לבריאות הילד והתפתחות האדם (HD008913 מענק ג-HL), והמרכז טכנולוגיית המידע (PGM, NP, ESM , ו MM).
Materials
| Software | |||
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | version 16.05 | for image deconvolution (https://svi.nl). commercial software |
| MIPAV | version 7.3.0 | for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/.). freeware | |
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaRetinalRegistration.class | freeware | ||
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandardColumnRegistration.class | freeware | ||
| Imaris | Bitplane | for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com). commercial software | |
| Vaa3D | for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/). freeware | ||
| Matlab | Mathworks | R2014b | for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com). commercial software |
| Matlab toolbox: TREES1.14 | v1.14 | for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html). freeware | |
| Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox | v1.0 | for calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Sample files | |||
| SWC file definition | http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html | ||
| The codes and sample files for image combination and registration | https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration | ||
| Reference point example | https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=1471880596000&api=v2 | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Computer system | |||
| MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later | 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal) | ||
| Optional: Quadro4000 (or above) graphic card | Nvidia | for stereographic visualization of dendrites. | |
| Optional: NVIDIA 3D vision2 | Nvidia | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html | |
| Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Reagents for imaging | |||
| 24B10 antibody | The Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Tag Antibody | Thermofisher Scientific | G10362 | |
| Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermofisher Scientific | A11034 | |
| Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermofisher Scientific | A21124 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mounting Clay | Fisher | S04179 | |
| 70% glycerol in 1X PBS | |||
| Cover glasses, high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9000-000 |
Referências
- Kaas, J. H. Topographic maps are fundamental to sensory processing. Brain Res Bull. 44 (2), 107-112 (1997).
- Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66 (1), 15-36 (2010).
- Huberman, A. D., Clandinin, T. R., Baier, H. Molecular and cellular mechanisms of lamina-specific axon targeting. CSH Perspect Biol. 2 (3), a001743 (2010).
- Clandinin, T. R., Feldheim, D. A. Making a visual map: mechanisms and molecules. Curr Opin Neurobiol. 19 (2), 174-180 (2009).
- Luo, J., McQueen, P. G., Shi, B., Lee, C. H., Ting, C. Y. Wiring dendrites in layers and columns. J Neurogenet. 30 (2), 69-79 (2016).
- Meinertzhagen, I. A., Hanson, T. E. . The development of the optic lobe. In The Development of Drosophila melanogaster. , 1363-1491 (1993).
- Takemura, S. Y., et al. A visual motion detection circuit suggested by Drosophila connectomics. Nature. 500 (7461), 175-181 (2013).
- Takemura, S. Y., et al. Synaptic circuits and their variations within different columns in the visual system of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (44), 13711-13716 (2015).
- Gao, S., et al. The neural substrate of spectral preference in Drosophila. Neuron. 60 (2), 328-342 (2008).
- Karuppudurai, T., et al. A hard-wired glutamatergic circuit pools and relays UV signals to mediate spectral preference in Drosophila. Neuron. 81 (3), 603-615 (2014).
- Strother, J. A., Nern, A., Reiser, M. B. Direct observation of ON and OFF pathways in the Drosophila visual system. Curr Biol. 24 (9), 976-983 (2014).
- Ting, C. Y., et al. Photoreceptor-derived activin promotes dendritic termination and restricts the receptive fields of first-order interneurons in Drosophila. Neuron. 81 (4), 830-846 (2014).
- Ting, C. Y., et al. Tiling of R7 axons in the Drosophila visual system is mediated both by transduction of an activin signal to the nucleus and by mutual repulsion. Neuron. 56 (5), 793-806 (2007).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Takemura, S. Y., Lu, Z., Meinertzhagen, I. A. Synaptic circuits of the Drosophila optic lobe: the input terminals to the medulla. J Comp Neurol. 509 (5), 493-513 (2008).
- Takemura, S. Y., et al. Cholinergic circuits integrate neighboring visual signals in a Drosophila motion detection pathway. Curr Biol. 21 (24), 2077-2084 (2011).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Wu, Y., et al. Spatially isotropic four-dimensional imaging with dual-view plane illumination microscopy. Nat Biotechnol. 31 (11), 1032-1038 (2013).
- Popko, J., Fernandes, A., Brites, D., Lanier, L. M. Automated analysis of NeuronJ tracing data. Cytometry A. 75 (4), 371-376 (2009).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth. J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).
- Scorcioni, R., Polavaram, S., Ascoli, G. A. L-Measure: a web-accessible tool for the analysis, comparison and search of digital reconstructions of neuronal morphologies. Nat Protoc. 3 (5), 866-876 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric Estimation from Incomplete Observations. JASA. 53, 457-481 (1958).
