Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas
Summary
Aquí, se muestra cómo analizar enrutamiento dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas. El flujo de trabajo incluye una visualización dual técnica de imagen para mejorar la calidad de imagen y herramientas computacionales para el seguimiento, el registro de los cenadores dendríticas en la matriz de la columna de referencia y para el análisis de las estructuras dendríticas en el espacio 3D.
Abstract
En muchas regiones del sistema nervioso central, tales como los lóbulos ópticos de la mosca y la corteza de los vertebrados, los circuitos sinápticos se organizan en capas y columnas para facilitar el cableado del cerebro durante el desarrollo y tratamiento de la información en los animales desarrollados. las neuronas postsinápticas dendritas elaboradas en los patrones específicos de tipo en capas específicas que hacen sinapsis con las terminales presinápticas apropiadas. El neurópila mosca médula se compone de 10 capas y alrededor de 750 columnas; cada columna está inervado por las dendritas de más de 38 tipos de neuronas medulares, que responden a las terminales axonales de unos 7 tipos de aferentes de una manera específica del tipo. Este informe detalla los procedimientos para analizar la imagen y dendritas de las neuronas medulares. El flujo de trabajo incluye tres secciones: (i) la sección de formación de imágenes de doble vista combina dos pilas de imágenes confocal recogidos en las orientaciones ortogonales una imagen en 3D de alta resolución de las dendritas en; (Ii) la dendrita rastreo y registro de huellas sección dendríticascenadores en 3D y los registros de huellas dendríticas en la matriz de la columna de referencia; (Iii) la sección de análisis dendríticas analiza los patrones dendríticas con respecto a las columnas y capas, incluyendo la terminación y la proyección plana dirección de capa específica de cenadores dendríticas, y calcula las estimaciones de ramificación y de terminación de frecuencias dendríticas. Los protocolos utilizan plugins personalizados construidos en la MIPAV de código abierto (Procesamiento de Imágenes Médicas, análisis y visualización) cajas de herramientas personalizadas de la plataforma y en el idioma de laboratorio matriz. En conjunto, estos protocolos proporcionan un flujo de trabajo completo para analizar el enrutamiento dendríticas de Drosophila neuronas médula en capas y columnas, para identificar tipos de células, y para determinar defectos en los mutantes.
Introduction
Durante el desarrollo, las neuronas dendritas elaboradas en los patrones complejos ramificados, pero estereotipados para formar sinapsis con sus socios presináptica. patrones de ramificación dendríticas se correlacionan con la identidad y las funciones neuronales. Las ubicaciones de los cenadores dendríticas determinan el tipo de entradas presinápticos que reciben, mientras que la ramificación dendrítica de complejidad y de campo tamaños gobiernan el número de entrada. Por lo tanto, las propiedades morfológicas dendríticas son elementos indispensables para la conectividad sináptica y la computación neuronal. En muchas regiones del cerebro complejos, tales como los lóbulos ópticos de la mosca y la retina de los vertebrados, los circuitos sinápticos están organizados en columnas y capas para facilitar el procesamiento de información 1, 2. En una organización tan columna y capa, las neuronas presinápticas de un axones distintos proyectos modalidad para terminar en una capa específica (denominada orientación-capa específica) y para formar una matriz bidimensional ordenada (la called mapa topográfico), mientras que las neuronas postsinápticas se extienden dendritas de tamaños apropiados en capas específicas para recibir aportes presinápticas de los tipos y números correctos. Si bien la orientación axonal a las capas y columnas ha sido bien estudiado 3, 4, se sabe mucho menos acerca de cómo dendritas se encaminan a capas específicas y ampliar adecuadamente dimensionados campos receptivos para formar conexiones sinápticas con los socios correctos presináptica 5. La dificultad de formación de imágenes y la cuantificación de la orientación dendrítica de capas y columnas ha dificultado el estudio del desarrollo dendrítico en las estructuras cerebrales columnares y laminados.
Drosophila neuronas médula son un modelo ideal para el estudio de enrutamiento dendríticas y ensamblaje de circuitos en las columnas y capas. El neurópila mosca médula está organizada como una celosía en 3D de 10 capas y aproximadamente 750 columnas. Cada columna está inervado por un conjunto de fibras aferentes, incluyendo photoreceptors R7 / R8 y neuronas de la lámina L1 – L5, cuyos terminales axonal formar mapas topográficos de una manera específica de la capa 6. Alrededor de 38 tipos de neuronas medulares están presentes en cada columna de médula y dendritas elaboradas en capas específicas y con tamaños de los campos apropiados para recibir las aportaciones de estos aferentes 7. Los circuitos sinápticos en la médula se han reconstruido a nivel microscópico de electrones; por lo tanto, las asociaciones sinápticas están bien establecidos 7, 8. Además, herramientas genéticas para el etiquetado de diferentes tipos de neuronas médula están disponibles 9, 10, 11. Mediante el examen de tres tipos de transmedulla (TM), las neuronas (TM2, TM9 y TM20), hemos identificado previamente dos atributos de tipo celular específico dendríticas: (i) las neuronas se proyectan Tm dendritas, ya sea en la dirección anterior o posterior (proy planadirección reflexión), dependiendo de los tipos de células y (ii) dendritas de las neuronas médula terminar en capas médula específicos de una forma de células de tipo específico (terminación de capa específica) 12. Planar dirección de proyección y la terminación de capa específica son suficientes para diferenciar estos tres tipos de neuronas Tm, mientras que las mutaciones que alteran las respuestas de Tm a capa y columnas señales afectan a distintos aspectos de estos atributos.
A continuación, presentamos un flujo de trabajo completo para el examen de los patrones dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas (Figura 1). En primer lugar, se muestra un método de imagen de doble vista, que utiliza software personalizado para combinar dos imagen confocal pilas para generar imágenes isotrópicas de alta calidad. Este método requiere solamente la microscopía confocal convencional para generar imágenes de alta calidad que permitan el rastreo fiable de ramas dendríticas, sin recurrir a la super-resolución microscopía, como unas STED (emisión estimulada agotamiento) o iluminación estructural. En segundo lugar, se presenta un método para el seguimiento de los cenadores dendríticas y para el registro de las huellas resultantes de neuritas a una matriz columna de referencia. En tercer lugar, se muestran los métodos computacionales para la extracción de información en la dirección de proyección planar y la terminación de la capa específica de dendritas, así como para derivar estimaciones de ramificación y de terminación de frecuencias dendríticas. Juntos, estos métodos permiten la caracterización de patrones dendríticas en 3D, la clasificación de los tipos de células sobre la base de morfologías dendríticas, y la identificación de posibles defectos en los mutantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, se muestra cómo reproducir y analizar los árboles dendríticos de neuronas medulares de Drosophila. En la primera sección, de doble punto de vista de imagen, se describe la deconvolución y la combinación de dos pilas de imágenes en una pila de imágenes de alta resolución. La segunda sección, el trazado de las dendritas y el registro, se describe el rastreo y registro de las dendritas de las neuronas medulares en la matriz de la columna de referencia. En la tercera sección, el análisis dendrít…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano (subvención HD008913 a C-HL), y el Centro de Tecnología de la Información (PGM, NP, ESM y MM).
Materials
| Software | |||
| Huygens Professional | Scientific Volume Imaging | version 16.05 | for image deconvolution (https://svi.nl). commercial software |
| MIPAV | version 7.3.0 | for image recombination and registration (http://mipav.cit.nih.gov/.). freeware | |
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaRetinalRegistration.class | freeware | ||
| MIPAV plugin: PlugInDrosophilaStandardColumnRegistration.class | freeware | ||
| Imaris | Bitplane | for tracing neurites and assigning reference points for image registration (http://www.bitplane.com). commercial software | |
| Vaa3D | for visualizing swc files (https://github.com/Vaa3D/release/releases/). freeware | ||
| Matlab | Mathworks | R2014b | for morphometric analysis of dendrites (http://www.mathworks.com). commercial software |
| Matlab toolbox: TREES1.14 | v1.14 | for analyzing dendritic morphometric parameters (http://www.treestoolbox.org/download.html). freeware | |
| Matlab toolbox: Dendritic_Tree_Toolbox | v1.0 | for calculating morphometric parameters (https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration). Freeware | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Sample files | |||
| SWC file definition | http://www.neuronland.org/NLMorphologyConverter/MorphologyFormats/SWC/Spec.html | ||
| The codes and sample files for image combination and registration | https://science.nichd.nih.gov/confluence/display/snc/Data+collections+for+imagines+combination+and+standardize+column+registration | ||
| Reference point example | https://science.nichd.nih.gov/confluence/download/attachments/117216914/points.csv?version=1&modificationDate=1471880596000&api=v2 | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Computer system | |||
| MS Windows Windows 7 x64 or Macintosh OS X 10.7 or later | 3GHz 64-bit quad-core processor, 16G RAM (minimal) | ||
| Optional: Quadro4000 (or above) graphic card | Nvidia | for stereographic visualization of dendrites. | |
| Optional: NVIDIA 3D vision2 | Nvidia | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-main.html | |
| Optional: 120 Hz LCD display for NVIDIA 3D vision2 | http://www.nvidia.com/object/3d-vision-system-requirements.html | ||
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Reagents for imaging | |||
| 24B10 antibody | The Developmental Studies Hybridoma Bank | 24B10 | |
| GFP Tag Antibody | Thermofisher Scientific | G10362 | |
| Goat anti-Rabbit (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermofisher Scientific | A11034 | |
| Goat anti-Mouse (H+L), Alexa Fluor 568 | Thermofisher Scientific | A21124 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Mounting Clay | Fisher | S04179 | |
| 70% glycerol in 1X PBS | |||
| Cover glasses, high performance, D=0.17mm | Zeiss | 474030-9000-000 |
Referências
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