Använda mikroflödessystem enheter för att mäta livslängd och Cellular fenotyper i Single Budding jästceller

Summary

I denna artikel presenteras ett protokoll optimerad för produktion av mikrofluidchips och installationen av mikrofluid experiment för att mäta livslängden och cellulära fenotyper av enstaka jästceller.

Abstract

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

Introduction

Spirande jäst är en kraftfull modellorganism i äldreforskning. Emellertid en konventionell livslängd analys i jäst är beroende av microdissection, som inte bara är arbetsintensiv utan också låg genomströmning ^{1, 2.} Dessutom behöver den traditionella microdissection tillvägagångssätt inte ger en detaljerad vy av olika cellulära och molekylära funktioner i de samlade moderceller som de gamla. Utvecklingen av mikrofluidanordningar har möjliggjort en automatiserad procedur för att mäta jäst livslängd såväl som att följa molekylära markörer och olika cellulära fenotyper under hela livet av modercellerna ^{3, 4, 5, 6, 7, 8.} Efter jästceller laddas i en mikrofluidanordning kan de spåras under ett mikroskop med användning av automatiska tids varve avbildning. Med hjälp av avbildning bearbetningsverktyg kan olika cellulära och molekylära fenotyper extraheras ^{tre, sex, åtta,} inklusive livslängd, storlek, fluorescerande reporter, cellmorfologi, cellcykeldynamik, etc, av vilka många är svåra eller omöjliga att erhålla med användning av den traditionella microdissection metoden. Mikrofluidikanordningar har fått en framträdande plats i jäst åldrande forskning eftersom deras framgångsrik utveckling för några år sedan ^{3, 4, 6, 7.} Flera grupper har därefter publicerat på varianter av de tidigare konstruktioner ⁵ och många jäst labs har använt mikroflödessystem enheter för sina studier.

I en cellkultur som undergår exponentiell tillväxt, antalet åldrade moderceller som är tillgängliga för observation är miniscule. Därför är den allmänna principen om mikroflödessystem enheten design för livslängdsmätningar att behålla moderceller och för att avlägsna dotterceller. En sådana konstruktioner utnyttjar det faktum att jäst genomgår asymmetrisk celldelning. Strukturerna i den enheten kommer fällan större moderceller och möjliggör mindre dotterceller som skall tvättas bort. Mikroflödeschipet som beskrivs i denna artikel använder ett mjukt polydimetylsiloxan (PDMS) dyna (vertikala Pensile kolumner) för att fånga moderceller (Figur 1). Anordningar av liknande utformning har tidigare ^{3, 4, 6, 7} rapporterats. Detta protokoll använder ett enklare förfarande för att tillverka mikrofluidanordningar och en enkel cellladdningsmetod som är optimerad för de tidsförlopp imaging experiment. En av de viktigaste parametrarna i mikrofluidanordningen är bredden av de PDMS dynor som används för att fälla moderceller. vår dEvice använder bredare kuddar som kan hålla fler moderceller under varje pad, inklusive en betydande del av färska moderceller som kan spåras under hela deras livslängd. Förutom livslängdsmätningar, är detta protokoll användbar för enkelcelltidsförlopp imaging experiment när cellerna måste spåras i många generationer, eller när en observation genom hela livslängd är nödvändigt.

Protocol

1. Kiselskiva Mold Fabrication OBS: Fotomasken är utformad med AutoCAD och tillverkas av ett kommersiellt företag. Denna design innehåller tre skikt av olika mönster ( Kompletterande File 1 ). Höjderna av de första, andra, och tredje skikten är ungefär 4 pm, 10 pm och 50 pm, respektive. Den kiselskiva formen skapades från fotomasken med hjälp mjuk litografi 9, <sup class="…

Representative Results

Efter experimenten kan livslängder av cellerna och många cellulära och molekylära fenotyper extraheras från de inspelade time-lapse bilder. Eftersom det finns ett antal olika funktioner som kan extraheras från varje cell, är det första steget av analysen för att kommentera cellerna och händelser, inklusive positionerna och gränserna för cellerna och timingen av olika händelser som håller på att spåras, såsom som spirande händelser. Dessa anteckningar kommer att göra de…

Discussion

PDMS-enhet måste nybakade. Annars kommer luftbubblorna som orsakas genom införing rören i anordningen vara svåra att avlägsna. Steg 3,4 är viktigt för att förbättra cellbelastning effektiviteten genom att koncentrera cellerna. Att öka genomströmningen av experimentet, 4 till 6 moduler på samma PDMS-chip anslutna till oberoende arbetande pumpar används typiskt för att utföra fyra till sex olika experiment (olika stammar eller medie kompositioner) samtidigt.

Jämfört med den ko…

Materials

3'' <111> silicon wafer	Addison Engineering
SU-8 2000 and 3000 Series	MicroChem
SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT	ellsworth	2065622	Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
Petri dishes	VWR	391-1502
Harris Uni-core™ punch(I.D. 0.75 mm)	Sigma-Aldrich	29002513
24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass	Thermo Fisher Scientific	102440
3M  Scotch Tape	ULINE	S-10223
VWR® Razor Blades	VWR	55411-050
PURE ETHANOL, KOPTEC	VWR	64-17-5
WHOOSH-DUSTER™	VWR	16650-027
5mL BD Syringe (Luer-Lock™Tip)	Becton, Dickinson and Company.	309646
PTFE Standard Wall Tubing (100ft, AWG Size:22, Nominal ID: 0.028)	COMPONENT SUPPLY COMPANY	SWTT-22
Needle Assortment	COMPONENT SUPPLY COMPANY	NEKIT-1
Desiccator	HACH	2238300
Lab Oven	FISHER SCIENTIFIC	13246516GAQ
Nikon TE2000 microscope with 40x and 60x objective	Nikon
Zeiss Axio Observer Z1 with 40x and 60x objective	Zeiss
Syringe Pump	Longerpump	TS-1B