استخدام الإنزيم بيوسينسور كوندوكتيميتريك β-lactamase المستندة إلى الكشف عن التفاعلات الجزيئية البيولوجية
Summary
في هذا العمل، نحن تقرير أسلوب جديد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين استخدام بيوسينسور كوندوكتيميتريك على أساس تكنولوجيا β-lactamase الهجين. ويعتمد هذا الأسلوب على الإفراج عن البروتونات عند التحلل من β-لاكتامس.
Abstract
أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تزداد أهمية وتنفيذها في مختلف الميادين مثل الكشف عن مسببات المرض والتشخيص الجزيئي، والرصد البيئي، ومراقبة سلامة الأغذية. وفي هذا السياق، استخدمنا lactamases بيتا كمراسل كفاءة الإنزيمات في عدة دراسات التفاعل البروتين-بروتين. وعلاوة على ذلك، تشجع قدرتها على قبول الملاحق من الببتيدات أو منظم البروتينات/المجالات بشدة استخدام هذه الإنزيمات لتوليد بروتينات تشيميريك. في دراسة أجريت مؤخرا، ونحن إدراج جزء من جسم مجال واحد في بلاب Bacillus ليتشينيفورميس β-lactamase. يتم تعريف هذه المجالات الصغيرة، وتسمى أيضا نانوبوديس، كنطاقات مستضد ملزمة للأجسام المضادة واحد في سلسلة من الإبليات. وتظهر مثل الأجسام المضادة المشتركة لسلسلة مزدوجة، الانتماءات عالية والخصوصيات لأهدافها. معارضها البروتين تشيميريك الناتجة من تقارب عالية ضد هدفه مع الاحتفاظ بالنشاط β-lactamase. وهذا يوحي أن تظل مويتيس نانوبودي و β-lactamase الوظيفية. في هذا العمل، نحن تقرير بروتوكول مفصل الذي يجمع بين نظامنا β-lactamase الهجين للتكنولوجيا بيوسينسور. ويمكن الكشف عن ملزمة محددة من نانوبودي إلى هدفها بفضل مقياس كوندوكتيميتريك للبروتونات الصادرة عن نشاط الإنزيم الحفاز.
Introduction
أجهزة استشعار العوامل البيولوجية هي الأجهزة التحليلية التي تجمع تفاعل الحيوي جزيئي مع أجهزة إرسال الإشارات الفيزيائية أو الكيميائية المشار إليها كمحولات الطاقة1. يمكن تفسير الإشارات المسجلة وتحويلها إلى رصد التفاعلات بين الشركاء المعطل تداولها ومجانا. معظم أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تنطوي على استخدام جسم مضاد للكشف عن تحليلها مثل الهرمونات أو علامات الممرض مختلفة2. تنسيقات استشعار مختلفة يمكن استخدامها، وتشمل هذه الأجهزة المستندة إلى كتلة أو مغناطيسية، بصرية أو الكهروكيميائية. هذه الأخيرة هي من بين الأكثر شيوعاً المستخدمة في أجهزة الاستشعار، وتعمل عن طريق تحويل حدث ملزم إلى إشارة كهربائية. الأداء والحساسيات جميع هذه الأجهزة المستندة إلى جسم تعتمد بشدة على أساسا معلمتين من معلمات: ط) نوعية الجسم والثاني) خصائص النظام المستخدمة لتوليد إشارة2.
الأجسام المضادة هي بروتينات dimeric كتلة عالية-الجزيئية (150 – 160 كاتشين) التي تتألف من اثنين من سلاسل ثقيلة واثنين من سلاسل خفيفة. واستقرت بالتفاعل بين السلاسل الخفيفة والثقيلة معظمها التفاعلات مسعور، فضلا عن سندات ثنائي كبريتيد مصانة. ويشمل كل سلسلة متغير مجال الذي يتفاعل مع مستضد أساسا عبر ثلاث مناطق هايبرفاريابل اسمه “مكملة تحديد المناطق” (CDR1-2-3). وعلى الرغم من العديد من التطورات في هذا المجال، التعبير على نطاق واسع من أجسام كاملة الطول مع أنظمة تعبير منخفضة التكلفة (مثل كولاي) غالباً ما يؤدي إلى إنتاج بروتينات غير مستقرة ومجمعة. وهذا السبب في مختلف أجزاء جسم قد تم إجراء هندسة عكسية مثل متغير واحد-سلسلة الأجزاء3 (سكففس ≈ كاتشين 25). وهي تتألف من مجالات متغير واحد على التوالي الثقيلة وسلاسل خفيفة واحدة مرتبطة تساهميا بتسلسل الأحماض الأمينية اصطناعية. بيد أن هذه الشظايا غالباً ما تعرض استقرار فقراء ولديهم ميل لتجميع، نظراً لأنها تعرض جزء كبير من مناطقها مسعور ل المذيبات4. وفي هذا السياق، يبدو أن سلسلة واحدة الكامليد جسم الشظايا، يشار إلى نانوبوديس أو فحص، بدائل ممتازة سكففس. تتوافق هذه المجالات إلى مجالات متغير من الأجسام المضادة أحادية السلسلة الكامليد. على النقيض من الأجسام المضادة التقليدية، الأجسام المضادة الكامليد تخلو من سلاسل خفيفة وتحتوي فقط على اثنين من سلاسل ثقيلة5. ولذلك، نانوبوديس هي أصغر جسم أحادي الأجزاء (12 كاتشين) قادرة على ربط مستضد مع تقارب مماثل للأجسام المضادة التقليدية6. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنها تعرض تحسين الاستقرار والقابلية للذوبان في مقارنة بغيرها طول الأجسام المضادة أو أجزاء جسم. أخيرا، أحجام صغيرة وعلى الحلقات CDR3 الموسعة يسمح لهم بالاعتراف بخفي [ابيتوبس] وربط إنزيم مواقع نشطة7،8. في الوقت الحاضر، هذه المجالات التي تحظى باهتمام كبير وتضافرت للتكنولوجيا بيوسينسور. على سبيل المثال، هوانغ وآخرون. وقد وضعت بيوسينسور على أساس نانوبودي للكشف والتحديد الكمي للبشرية مستضد البروستات محددة (PSA)9.
كما ذكر أعلاه، هو معياراً هاما في فحوصات biosensor كفاءة النظام المستخدمة لتوليد إشارة كهربائية. ولهذا السبب، المستندة إلى إنزيم أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية تجتذب اهتماما متزايداً، وقد استخدمت على نطاق واسع لمختلف التطبيقات مثل الرعاية الصحية والسلامة الغذائية، والرصد البيئي. أجهزة الاستشعار هذه تعتمد على التحلل الحفاز من الركازة بإنزيم لتوليد الإشارة الكهربائية. وفي هذا السياق، عرضت β-لاكتاماسيس أن تكون أكثر تحديداً، وأكثر حساسية وأسهل في التنفيذ تجريبيا من العديد من الإنزيمات الأخرى مثل الفوسفاتيز القلوية أو الفجل البيروكسيديز10. Β-lactamases هي الإنزيمات التي المسؤولة عن مقاومة الجراثيم للمضادات الحيوية بيتا لاكتام التي هيدروليزينج لهم. وهم أحادي، ومستقرة جداً، والكفاءة، وصغيرة الحجم. وعلاوة على ذلك، تولد الملاحق المجال/الببتيد إلى β-lactamases البروتينات تشيميريك ثنائية-الوظائف التي عرضت أن تكون أدوات فعالة لدراسة تفاعلات البروتين-يجند. في الواقع، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن إدراج أجزاء جسم متغير في نتائج β-lactamase TEM1 في بروتين تشيميريك التي ما زالت قادرة على ربط مع تقارب عالية على مستضد المستهدفة به. من المثير للاهتمام، والربط مستضد أبدى للحث على تنظيم نشاط الحفاز TEM111،12اللوستيريك. وعلاوة على ذلك، أظهرت أننا في العديد من الدراسات أن الإدراج المجال البروتين في حلقة متساهلة من Bacillus ليتشينيفورميس بلاب β-lactamase يولد البروتينات تشيميريك الوظيفية التي مناسبة تماما لرصد تفاعلات البروتين-يجند13 ،14. ونحن مؤخرا إدراج نانوبودي، اسمه كاب-Lys3، في هذا الموقع الإدراج المتساهلة بلاب15. وأبدى هذا نانوبودي لربط lysozyme الدجاجة-البيض-أبيض (هول) وكبح النشاط الأنزيمي16. لقد أظهرنا أن البروتين الهجين الذي تم إنشاؤه، اسمه بلاب-كاب-Lys3، الاحتفاظ خصوصية عالية/تقارب ضد هول بينما ظل النشاط β-lactamase بدون تغيير. ثم أننا بنجاح الجمع بين التكنولوجيا الهجينة β-lactamase إلى biosensor الكهروكيميائية وأظهر أنه يعتمد التفاعل بين بلاب-كاب-Lys3 وهول معطلة في قطب كمية الإشارات الكهربائية التي تم إنشاؤها. وفي الواقع، يدفع التحلل من المضادات الحيوية بيتا لاكتام بلاب بيان بروتون التي يمكن تحويلها إلى إشارة كهربائية كمية. هذا المزيج من التكنولوجيا الهجينة β-lactamase مع biosensor الكهروكيميائية سريعة وحساسة، الكمية، ويتيح قياس الإشارات التي تم إنشاؤها في الوقت الحقيقي. ويرد وصف هذه المنهجية هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا العمل نقدم طريقة فونكتيوناليزي نانوبودي استخدام بلاب β-lactamase بروتين الناقل ونظهر أن يمكن أن ننفذ البروتين الهجين الناتجة بنجاح في مقايسة استشعار فرق الجهد. الجانب الابتكار الرئيسي لعملنا مقارنة بغيرها فحوصات بيوسينسور هو اقتران التساهمية الجزء الأجسام المضادة للنشاط الأنزيمي ال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف أصحاب المنطقة الفالونية لبلجيكا في إطار مشاريع البحوث سينسوتيم ونانوتيك وكذلك الوطنية الأموال للبحث العلمي (F.R.S.-F.N.R.S) لتقديم الدعم المالي.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
Referências
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O’Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L. Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D’Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors – Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E. Nanoscale potentiometry. Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- . . Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).
