Bruk av en β-lactamase-baserte Conductimetric Biosensor analysen å oppdage Biomolecular interaksjoner
Summary
I dette arbeidet rapporterer vi en ny metode for å studere protein-protein interaksjoner ved hjelp av en conductimetric biosensor basert på hybridteknologi β-lactamase. Denne metoden er avhengig av utgivelsen av protoner ved hydrolyse av β-lactams.
Abstract
Biosensors blir stadig mer viktig og implementert i ulike felt som patogen gjenkjenning, molekylær diagnose, miljøovervåking og mat sikkerhetskontroll. I denne sammenhengen brukte vi β-lactamases som effektiv reporter enzymer i flere protein-protein samhandling studier. Deres evne til å akseptere innsettinger peptider eller strukturert proteiner/domener sterkt oppfordrer videre bruk av disse enzymene generere chimeric proteiner. I en fersk studie inn vi et enkelt domene antistoff fragment Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Disse små domener, også kalt nanobodies, er definert som antigen bindende domener av enkelt kjede antistoffer fra camelids. Som vanlig dobbel kjeden antistoffer viser de høy slektskap og særegenheter for sine mål. Resulterende chimeric protein utstilt høy affinitet mot målet samtidig beholde β-lactamase aktiviteten. Dette tyder på at de nanobody og β-lactamase moieties fortsatt fungere. I den nåværende arbeidet rapportere vi en detaljert protokoll som kombinerer hybrid β-lactamase systemet biosensor teknologien. Bestemt binding av nanobody til målet kan oppdages takket være en conductimetric måling av protoner utgitt av katalytisk aktiviteten av enzymet.
Introduction
Biosensors er analytiske enheter som kombinerer en bio-molekylær interaksjon med fysisk eller kjemiske signalnettverk enheter kalles transdusere1. Registrert signalene kan deretter tolkes og for å overvåke samspillet mellom partnerne immobilisert og gratis. De fleste av biosensors innebærer bruk av et antistoff å oppdage analytter som hormoner eller annen patogen markører2. Skjellige formater kan brukes og inkludere masse-baserte, magnetisk, optisk eller elektrokjemisk biosensors. Sistnevnte er blant de mest brukte sensorer og fungerer ved å konvertere en bindende hendelse til et elektrisk signal. De forestillinger og sensitiviteten for alle antistoff-baserte biosensors er sterkt avhengig av hovedsakelig to parametere: i) kvaliteten på antistoffer og ii) egenskapene for systemet brukes til å generere signal2.
Antistoffer er høymolekylær masse dimeric proteiner (150-160 kDa) som består av to tunge kjeder og to lys kjeder. Samspillet mellom lette og tunge kjedene er hovedsakelig stabilisert hydrofobe samhandling samt en bevart disulfide obligasjon. Hver kjede omfatter en variabel domene som samhandler med antigen i hovedsak via tre hypervariable regioner heter komplementære bestemme regioner (CDR1-2-3). Til tross for mange fremskritt i feltet store uttrykket av full lengde antistoffer med rimelig uttrykk systemer (f.eks E. coli) ofte fører til produksjon av ustabil og aggregert proteiner. Det er derfor ulike antistoff fragmenter har blitt utviklet som enkelt-kjeden variabel fragmenter3 (ScFvs ≈ 25 kDa). De består av variabel domener av henholdsvis en tunge og en lys kjeder som covalently er knyttet sammen av en syntetisk aminosyresekvens. Men disse fragmentene ofte viser en dårlig stabilitet og har tendens til å samle, siden de viser en stor del av sine hydrofobe regioner til løsemiddel4. I denne sammenheng synes enkelt kjede Kamelid antistoff fragmenter, kalles nanobodies eller VHHs, å være gode alternativer til ScFvs. Disse domenene korresponderer til variabel domener av Kamelid single-kjeden antistoffer. I motsetning til konvensjonelle antistoffer, Kamelid antistoffer er blottet for lys kjeder og bare inneholde to tunge kjeder5. Nanobodies er derfor minste monomerisk antistoff fragmenter (12 kDa) kunne binde til et antigen med tilhørighet lik som konvensjonelle antistoffer6. I tillegg presenterer de forbedret stabilitet og løselighet sammenlignet med andre fulle antistoffer eller antistoff fragmenter. Til slutt, deres små størrelser og deres utvidet CDR3 looper tillate dem å gjenkjenne kryptiske epitoper og binder seg til enzymet aktive nettsteder7,8. I dag er disse domenene får betydelig oppmerksomhet og har vært sammen til biosensor teknologi. For eksempel Huang et al. har utviklet en nanobody-baserte biosensor av kvantifisering av menneskelig prostata-spesifikt antigen (PSA)9.
Som nevnt over er en viktig parameter biosensor analyser effektiviteten til systemet brukes til å generere elektrisk signal. Derfor enzym-baserte elektrokjemisk biosensors har tiltrukket seg stadig økende oppmerksomhet og har vært brukt mye for ulike applikasjoner som helse, matsikkerhet og miljøovervåking. Disse biosensors er avhengige av katalytisk hydrolyse av et av et enzym å generere elektrisk signal. I denne sammenheng ble β-lactamases vist å være mer spesifikk, mer følsomme og lettere å implementere eksperimentelt enn mange andre enzymer som alkalisk fosfatase eller pepperrot peroxidase10. Β-lactamases er enzymer som er ansvarlig for bakteriell motstand mot β-Laktam antibiotika av hydrolyzing dem. De er monomerisk, veldig stabil, effektiv, og liten størrelse. Videre genererer domene/peptid innsettinger i β-lactamases bi-fungerende chimeric proteiner som ble vist å være effektive verktøy å studere protein-ligand interaksjoner. Faktisk har studier vist at innsetting av antistoff variabel TEM1 β-lactamase resultatene i et chimeric protein som fortsatt stand til å binde med høy affinitet til sine mål antigen. Interessant, ble antigen bindingen vist å indusere allosteric regulering av TEM1 katalytisk aktivitet11,12. Videre viste vi i flere studier at protein domene innsetting en ettergivende løkke av Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase genererer funksjonelle chimeric proteiner som er godt egnet til å overvåke protein-ligand interaksjoner13 ,14. Vi nylig satt inn en nanobody, kalt cAb-Lys3, i denne ettergivende innsetting site BlaP15. Denne nanobody ble vist å binde til hen-egg-hvit lysozyme (HEWL) og til å hemme den enzymatiske aktiviteten16. Vi viste at generert hybrid protein, kalt BlaP-cAb-Lys3, beholdt en høy spesifisitet / affinitet mot HEWL mens β-lactamase aktiviteten forble uendret. Vi har kombinert β-lactamase hybridteknologi å en elektrokjemisk biosensor og viste at mengden av genererte elektrisk signal var avhengige av samspillet mellom BlaP-cAb-Lys3 og HEWL immobilisert på en elektrode. Faktisk induserer hydrolyse av β-Laktam antibiotika av BlaP en proton utgivelse som kan konverteres til en kvantitativ elektrisk signal. Denne kombinasjonen av β-lactamase hybridteknologi med en elektrokjemisk biosensor er rask, følsom, kvantitativ, og gir sanntids måling av genererte signalet. Denne metodikken er beskrevet her.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbeidet presenterer vi en metode for å functionalize en nanobody med BlaP β-lactamase som en operatør protein og vi vise at vi lykkes kan implementere resulterende hybrid protein i en potentiometric sensor analysen. Det viktigste nyvinning aspektet av vårt arbeid i forhold til andre biosensor analyser er kovalente koblingen av antistoff delen som den enzymatiske aktiviteten som genererer elektrisk signal. Denne såkalte protein innsetting teknologien presenterer fordeler og begrensninger som vil være hovedf…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne bekrefter Vallonsk Region i Belgia innenfor rammen av forskningsprosjekter SENSOTEM og NANOTIC samt National midler For the forskning (F.R.S.-F.N.R.S) for deres støtte.
Materials
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
Referências
- Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
- Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O’Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
- Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
- Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
- Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
- Sheriff, S., Constantine, K. L. Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).
- Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
- Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
- Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
- Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
- Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
- Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
- Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
- Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
- Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
- Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
- Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
- Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
- Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
- Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
- Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
- Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
- Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968 (2015).
- Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
- Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
- Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
- Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
- Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
- Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
- Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168 (2012).
- Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
- D’Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
- Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
- Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
- Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
- Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors – Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
- Bakker, E., Pretsch, E. Nanoscale potentiometry. Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).
- Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
- Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
- . . Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , (2013).
