O uso de um ensaio de β-lactamase-baseado titulometria Biosensor para detectar interações biomoleculares

Resumo

Neste trabalho, relatamos um novo método para estudar as interações da proteína-proteína usando um biossensor titulometria, baseado na tecnologia de β-lactamases de híbrido. Este método baseia-se na liberação de prótons após hidrólise da β-lactamas.

Resumo

Biosensores estão se tornando cada vez mais importante e implementadas em várias áreas tais como detecção de agentes patogénicos, diagnóstico molecular, monitoramento ambiental e controle de segurança de alimentos. Neste contexto, usamos β-lactamases como enzimas repórter eficiente em vários estudos de interação da proteína-proteína. Além disso, sua capacidade de aceitar inserções de peptídeos ou proteínas/domínios estruturados fortemente incentiva o uso destas enzimas para gerar proteínas quiméricas. Em um estudo recente, inserimos um fragmento de anticorpo de domínio único para o β-lactamases de Bacillus licheniformis BlaP. Estes domínios pequenos, também chamados de nanobodies, são definidos como domínios de ligação de antígeno de anticorpos de cadeia única de camelídeos. Como comum anticorpos de cadeia dupla, eles mostram afinidades altas e especificidades para seus alvos. Proteínas quiméricas resultantes exibiram uma afinidade elevada contra seu destino mantendo a atividade de β-lactamase. Isto sugere que as partes nanobody e β-lactamases permanecem funcionais. No presente trabalho, relatamos um protocolo detalhado que combina o nosso sistema de β-lactamases de híbrido para a tecnologia biosensor. A vinculação específica da nanobody ao seu alvo pode ser detectada graças a uma medição titulometria dos prótons liberados pela atividade catalítica da enzima.

Introdução

Biosensores são dispositivos analíticos que combinam uma interação bio-molecular com dispositivos de sinalização físicos ou químicos conhecido como transdutores¹. Os sinais gravados podem ser interpretados e convertidos para monitorar as interações entre os parceiros de imobilizado e livre. A maioria dos biosensores envolve o uso de um anticorpo para detectar analitos tais como hormonas ou patógeno diferentes marcadores². Sensor de diferentes formatos podem ser usados e incluem biosensores baseados em massa, magnéticos, ópticos ou eletroquímicos. O último está entre os mais comumente usados sensores e função, convertendo....

Protocolo

1. proteína preparação da amostra

1. Produzir e purificar a proteína híbrida BlaP-táxi-Lys3 como relatado no nosso anterior estudo¹⁵. Armazenar a proteína em 50mm tampão fosfato pH 7,4 com a seguinte composição: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ e 0,24 g de KH₂PO₄ dissolvida em 800 mL de água destilada corrigir o pH da solução a 7,4 antes ajustando o volume final da solução a 1 L. Filter esterilizar a solução de proteína.
2. Prepare uma solução stock de galinha ovo lisozima (HEWL). Dissolva 100 mg (40.000 unidades/mg) de HEWL adquirido comercialmente em 10 mL de solução salina....

Resultados

Design e engenharia das proteínas quiméricas BlaP-táxi-Lys3

A Figura 1 representa a inserção de táxi-Lys3 em um loop permissiva da BalP classe A β-lactamases de Bacillus licheniformis. A inserção foi realizada entre resíduos Asp198 e Lys199. Um local de clivagem de trombina foi introduzido em cada lado do táxi-Lys3. As células transformadas com um plasmídeo de expressão constitutiva codificação da proteína quimérico BlaP-t.......

Discussão

Neste trabalho apresentamos um método para funcionalizar um nanobody usando o BlaP β-lactamase como uma proteína transportadora e mostramos que podemos implementar com êxito a proteína híbrida resultante em um ensaio de sensor potenciométrico. O aspecto principal inovação do nosso trabalho em comparação com outros ensaios biosensor é o acoplamento covalente da parte de anticorpo para a atividade enzimática que gera o sinal elétrico. Esta tecnologia de inserção de proteína chamada apresenta vantagens e limitações que serã.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagents
KH2PO4	Sigma-Aldricht	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldricht	1551128
NaCl	Sigma-Aldricht	S7653
Tris– HCl	Roche	10812846001
EDTA	Sigma-Aldricht	E9884
KCl	Sigma-Aldricht	P9541
Na2HPO4	Sigma-Aldricht	NIST2186II
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldricht	M6250
alanina	Sigma-Aldricht	A7627
HClO4	Fluka	34288	1M HClO4 solução, distribuidor : Sigma-Aldricht
hidrolisado de caseína	Sigma-Aldricht	22090
benzilpenicilina sódica	Sigma-Aldricht	B0900000
ovo de galinha lisozima	Roche	10837059001
heptano	Sigma-Aldricht	246654
metanol	Sigma-Aldricht	322415
solução de hidróxido de amônio	Sigma-Aldricht	380539	28% NH3  em H2O, purificado por dupla destilação (concentrado?)
Consumíveis de laboratório
placa de 6 poços	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR Medidor de pH>< Placa de 6 Poços
Medidor de
	de Laboratório WTW	1AA110	inoLab pH 7110
	NALG300	Porta-filtros com receptor, distribuidor : Chips
		sensor potenciométrico	fabricados pela Yunus e colegas (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		descontinuado, sucessor Autolab PGSTAT302N
multímetro digital, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		descontinuado, sucessor Metrahit Base

clara de pH Sistema de vácuo e filtragem de VWR