Ved hjelp av enzymbaserte Biosensorer å måle Tonic og phasic Glutamat i Alzheimers musemodeller
Summary
Her beskriver vi oppsettet, programvare navigasjon, og dataanalyse for et romlig og tidsmessig nøyaktig metode for å måle tonic og fase-ekstracellulær glutamat endringer in vivo ved hjelp av enzym-bundet mikroelektrode arrays (MEA).
Abstract
Nevrotransmitter forstyrrelser er ofte en viktig del av sykdommer i sentralnervesystemet (CNS), som spiller en rolle i patologien underliggende Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, depresjon og angst. Tradisjonelt har mikrodialyse har vært den mest vanlige (hyllet) teknikk for å undersøke nevrotransmitter endringer som oppstår i disse forstyrrelsene. Men fordi mikrodialyse har evnen til å måle langsomme 1-20 minutt endringer over store deler av vev, har den ulempen med invasivitet, potensielt ødelegge iboende forbindelser i hjernen og en langsom prøvetaking evne. En forholdsvis nyere teknikk, mikroelektroden array (MEA), har tallrike fordeler for måling av spesifikke nevrotransmitter endringer i diskrete hjerneområder etter hvert som de forekommer, noe som gir en romlig og tidsmessig nøyaktig tilnærming. I tillegg, ved bruk MEAs er minimal invasiv, slik at for måling av nevrotransmitteren endringer in vivo. I vårt laboratorium, vi hahar vært spesielt interessert i endringer i neurotransmitter, glutamat, relatert til patologien ved Alzheimers sykdom. Som sådan, er den fremgangsmåten som beskrives her er brukt til å vurdere potensielle hippokampale forstyrrelser i glutamat i en transgen musemodell for Alzheimers sykdom. I korthet, den metode som brukes omfatter belegning av et multi-site mikroelektrode med et enzym som er meget selektiv for den nevrotransmitter av interesse, og ved anvendelse av selvreferansesider for å trekke fra bakgrunnsstøy og interferenter. Etter utsåing og kalibrering, kan det MEA være konstruert med en mikropipette og senkes ned i hjerneområdet av interesse ved hjelp av en stereotaktisk anordning. Her er fremgangsmåten som er beskrevet innebærer bedøvelse RTG (TauP301L) 4510 og mus ved hjelp av en stereotaksisk anordning til nøyaktig å målrette subregioner (DG, CA1, og CA3) av hippocampus.
Introduction
Måling av nevrotransmitter endringer i hjernen er et viktig verktøy for å studere nevro sykdommer i sentralnervesystemet (CNS), som kjennetegnes ofte av nevrotransmitter dysregulering. Selv om mikrodialyse i kombinasjon med høytrykks-væskekromatografi (HPLC / EC) har vært den mest anvendte metoden for å måle endringer i ekstracellulære nevrotransmitter nivåer 1, 2, 3, 4, den romlige og tidsmessige bestemte oppløsningen av mikrodialyse-probene kan ikke være ideell for nevrotransmittere , slik som glutamat, som er tett regulert i det ekstracellulære rom 5, 6. På grunn av den nylige fremskritt innen genetikk og billeddannelse, er det flere metoder som kan brukes til å kartlegge glutamat in vivo. Ved hjelp av genetisk kodede glutamat fluorescerende rapportører (iGluSnFR) etd to-foton avbildning, forskere er i stand til å visualisere glutamatfrigiving av neuroner og astrocytter både in vitro og in vivo 7, 8, 9. Spesielt, tillater dette tas opp fra et større synsfelt og ikke forstyrrer ikke den iboende forbindelsene til hjernen. Selv om disse nye optiske teknikker tillate visualisering av glutamatkinetikk og måling av sensoriske fremkalte responser og neuronal aktivitet, de mangler evnen til å kvantifisere mengden av glutamat i det ekstracellulære rom i diskrete hjerneområder.
En alternativ metode er den enzymbundne mikroelektrode array (MEA) som selektivt kan måle ekstracellulære nevrotransmitter nivåer, som for eksempel glutamat, ved bruk av en selv referert opptak ordningen. MEA teknikken har blitt brukt til å studere forandringer i ekstracellulær glutamat etter traumatisk hjerneskadeskade 10, 11, 12, aldring 13, 14, stresset 15, 16, epilepsi 17, 18, Alzheimers sykdom 19, 20, og injeksjon av en viral etterligne 21 og representerer en forbedring i forhold til de rommessige og tidsmessige begrensninger som ligger i mikrodialyse. Mens mikrodialyse begrenser muligheten for å måle nær synapsen 22, 23, MEAs har en høy romlig oppløsning som gjør det mulig for selektive målinger av ekstracellulær glutamat overløp nær synapser 24, 25. For det andre, den lave tidsoppløsningen av mikrodialyse – begrenser (1 20 min) evnen til å undersøkeraske dynamikken i glutamatfrigjøring og klaringen som forekommer i millisekund til andre område 26. Fordi forskjeller i frigjørings eller klaring av glutamat kan ikke være innlysende på målinger av tonic, hviler glutamat nivå, kan det være nødvendig at glutamatfrigjøring og klaringen kan måles direkte. MEAs tillate for slike tiltak på grunn av deres høye tidsmessig oppløsning (2 Hz) og lave påvisningsgrenser (<1 um). For det tredje, MEAs muliggjøre undersøkelse av subregional variasjoner i nevrotransmittere i en bestemt hjerneområde, slik som rotte eller mus hippocampus. For eksempel, ved anvendelse av MEAs vi kan hver for målrette dentate gyrus (DG), ove ammonis 3 (CA3) og ove ammonis 1 (CA1) av hippocampus, som er forbundet via et trisynaptic krets 27, for å undersøke subregional forskjeller i ekstracellulær glutamat. På grunn av størrelsen på mikrodialyseprober (til 1 – 4 mm lengde), og skader forårsaket ved implantasjon 28 </ sup>, 29, subregionale forskjellene er vanskelig å ta opp. Videre er de optiske systemer bare tillater stimulering gjennom eksterne stimuli, slik som en whisker stimulering eller lys flimmer, som ikke tillater subregional stimulering 7. En endelig fordel med MEAs enn andre metoder er evnen til å studere disse subregioner in vivo uten å forstyrre deres ytre og indre forbindelser.
Her beskriver vi hvordan et opptakssystem (f.eks FAST16mkIII) i kombinasjon med MEAs, som består av et keramikk-baserte multisite mikroelektrode, kan differensielt belegges på opptakssider for å gi rom for forstyrrende stoffer som skal detekteres og fjernes fra analytten signal. Vi viser også disse matriser kan benyttes for amperometry baserte studier av in vivo-glutamat regulering innenfor DG, CA3, og CA1 hippocampus-subregioner av bedøvet RTG (TauP301L) 4510 mus, en vanlig brukt mouse modell for Alzheimers sykdom. I tillegg gir vi bekreftelse av følsomheten av MEA-systemet til den raske dynamikken i glutamatfrigjøring og klaring ved behandling av musene med riluzol, til et medikament in vitro vist å redusere glutamatfrigjøring og øke glutamat opptak 30, 31, 32, 33, og demonstrerer disse respektive endringer in vivo i TauP301L musemodellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
MEA teknikk tillater måling av raske kinetikk for nevrotransmitter-frigjøring og opptak in vitro og in vivo. Derfor frembringer den teknologi en rekke datautgangs inkludert tonisk nevrotransmitter nivåer fremkalt frigjøring av nevrotransmittere og nevrotransmitter klaring. Men fordi bruk av MEAs er en relativt komplisert prosedyre, er det mange faktorer som kan trenge å være optimalisert for vellykket bruk. For eksempel, i løpet av kalibreringen, kan man være oppmerksom på at det ikke er noen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institute of General Medical Sciences (MNR, U54GM104942), NIA (MNR, R15AG045812), Alzheimers Association (MNR, NIRG-12-242187), WVU fakultet Forskning Senatet Grant (MNR), og WVU PSCOR Grant (MNR).
Materials
| FAST-16mkIII-8 channel | Quanteon | 16mkIII | |
| Microelectrode arrays | CenMet | W4 or 8-TRK | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A-3059 | 10 g (expires after 1 month) |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G-6257 | 100 mL (expires after 6 months) |
| Glutamate Oxidase | US Biological or Sigma Aldrich | G4001-01 or 100646 | 50 UI (expires after 6 months) |
| Hamilton Syringes | Hamilton | #701 | 2 syringes |
| Methanol | BDH | UN1230 | 4 L |
| m-Phenylenediamine dihydrochloride (mPD) | ACROS Organics | 1330560250 | 25 g |
| Reference Electrodes (RE-5B) | BAS | MF-2079 | 3 electrodes |
| Magnetic stir plate | Cole-parmer | EW-04804-01 | Can purchase from different supplier |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G-1626 | 100 g |
| Ascorbic Acid | TCI | 50-81-7 | 500 g |
| Dopamine Hydrochloride | Alfa Aesar | 62-31-7 | 5 g |
| Perchloric acid | VWR | UN2920 | 500 mL |
| Postassium chloride | VWR | 7447-40-7 | 1 kg |
| Sodium chloride | VWR | 7647-40-7 | 1 kg |
| Calcium Chloride | MP | 153502 | 100 g |
| Sodium Hydroxide | BDH | 1310732 | 500 g |
| Glass pressure ejection pipettes | CenMet | ||
| Sticky wax | Kerrlab | 625 | Can purchase from different supplier |
| Microsyringe | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Modeling clay | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| Picospritzer III | Parker | ||
| Silver wire | AM systems | 782000 | |
| Hydrochloric acid | BDH | 7647010 | 2.5 L |
| Platinum wire | AM Systems | 778000 | |
| Solder gun | Lowes or Home Depot | Can purchase from different supplier | |
| Multimeter | WalMart | Can purchase from different supplier | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| SomnoSuite | Kent Scientific | Can purchase from different supplier | |
| Stereotaxic device | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Digital Lab Standard | Stoelting | Can purchase from different supplier | |
| Meiji EMZ microscope | Meiji | EMZ-5 | |
| Drill | Dremel | Micro | |
| Metricide | Metrex | 102800 | |
| Scalpel | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Surgery scissors | VWR | Can purchase from different supplier | |
| Sterile cotton swabs | Puritan | 25806 | Can purchase from different supplier |
| Eye ointment | Puralube Vet Ointment | Obtain from the vet | |
| Iodine swabs | VWR | S48050 | Can purchase from different supplier |
| Alcohol swabs | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Sterile surgery drape | Dynarex | 4410 | Can purchase from different supplier |
| Sterile saline | Teknova | S5815 | Can make own soltuion using filters |
| Hydrogen Peroxide (3%) | Local drug store | Can purchase from different supplier | |
| Heating Pad | WalMart | Can purchase from different supplier |
Referências
- Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
- Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
- Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
- Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
- Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
- He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
- Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441 (2016).
- Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
- Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), 187-200 (2011).
- Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
- Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), 811-820 (2009).
- Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
- Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), 619-627 (2012).
- Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
- Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neurociência. 202, 77-86 (2011).
- Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), 157-167 (2012).
- Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
- Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
- Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders–the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
- Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
- Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
- Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
- Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
- Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), 149-158 (2005).
- Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), 127-135 (2009).
- Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
- Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), 805-814 (2011).
- Frizzo, M. E., Dall’Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
- Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), 171-176 (2008).
- Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), 1626-1635 (2006).
- Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
- Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
- Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer’s disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
- Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).
