Fabricação de espumas de Matriz Extracelular derivados e Microcarregadores como cultura celular de tecidos específicos e plataformas de entrega

Summary

A matriz extracelular específico do tecido (ECM) é um mediador chave da função das células. Este artigo descreve métodos para a síntese de espumas e microtransportadores que são estáveis em cultura sem a necessidade de reticulação química para aplicações em 3D avançada em modelos de cultura celular in vitro ou como bioscaffolds pró-regenerativos derivado de ECM puros.

Abstract

função celular é mediada por interacções com a matriz extracelular (ECM), que tem a composição específica do tecido complexo e arquitectura. O foco deste artigo é sobre os métodos para o fabrico de espumas e microtransportadores porosos derivados de ECM para utilização como substratos biologicamente relevantes em 3D avançado em modelos de cultura celular in vitro ou como andaimes pró-regenerativos e sistemas de entrega da célula para a engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Utilizando tecidos descelularizados ou colagénio insolúvel purificada como um material de partida, as técnicas podem ser aplicados para sintetizar uma ampla variedade de bioscaffolds específicos de tecido, com geometrias de personalização. A abordagem envolve o processamento mecânico e digestão enzimática leve para se obter uma suspensão de ECM que é utilizado para fabricar as espumas tridimensionais ou microtransportadores através de procedimentos de congelamento e de liofilização controladas. Estes andaimes derivado de ECM puros são altamente poroso, ainda estável sem a necessidade de químicoal agentes ou outros aditivos que podem ter um impacto negativo a função das células de reticulação. As propriedades de andaime pode ser sintonizada em certa medida por factores variáveis, tais como a concentração de ECM suspensão, métodos mecânicos de processamento, ou as condições de síntese. Em geral, os andaimes são robusto e fácil de manusear, e pode ser processado como tecidos para a maioria dos ensaios biológicos padrão, proporcionando uma plataforma de cultura de células 3D versátil e fácil de usar, que mimetiza a composição ECM nativa. Em geral, estes métodos simples para o fabrico de espumas e microtransportadores derivado de ECM personalizadas podem ser de interesse para ambos os biólogos e engenheiros biomédicos como plataformas de células-instrutivo específicos de tecidos para in vitro e in vivo em aplicações.

Introduction

A matriz extracelular (ECM) é composto de uma rede 3D complexo de proteínas, glicoproteínas, e polissacarídeos ^1. Uma vez considerada como uma estrutura predominantemente estrutural, é agora bem reconhecido que a ECM incorpora um conjunto diversificado de moléculas bioactivas com importantes papéis funcionais ^2. Interacções célula-ECM pode dirigir a sobrevivência celular, adesão, migração, proliferação, diferenciação e ^3. Enquanto as principais classes de macromoléculas ECM são geralmente bem conservada entre tecidos e espécies, cada tecido tem uma composição de matriz única e arquitectura ^4. No geral, o ECM específico do tecido proporciona um microambiente instrutivo que medeia a função do sub-celular para a escala de tecido / órgão ^5.

Devido ao papel crítico do ECM na mediação função celular, tem havido um crescente interesse no desenvolvimento de bioscaffolds derivados do ECM para aplicações em engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Em particular, o método de descelularização tem sido amplamente explorados como um meio de obtenção de ECM de uma vasta gama de tecidos para utilização como um material de andaimes para a regeneração de tecidos e distribuição de célula ^{5, 6, 7.} Descelularização tipicamente envolve uma série de mecânicos, químicos e / ou fases de tratamento biológicas orientadas para a remoção de células e componentes celulares, enquanto idealmente causando alterações mínimas na estrutura 3D e composição da ECM ^8. Através de levantamento da literatura, vários protocolos de decelularização pode ser identificado por praticamente todos os tecidos do corpo ^7.

Embora os tecidos descelularizados podem ser utilizados directamente como andaimes implantáveis ​​ou substratos de cultura de culas 3D, infiltração celular podeser limitada em tecidos com uma estrutura densa ECM ^9. Além disso, a heterogeneidade natural no ECM podem causar variabilidade na ligação de células e distribuição dentro das matrizes descelularizados, o que poderia potencialmente impacto sobre a resposta celular ^10. Em geral, embora prometendo para algumas aplicações, a aplicação de tecidos descelularizados na sua forma intacta oferece versatilidade limitada em termos de propriedades de sintonização de andaime, incluindo forma, porosidade, e rigidez, bem como o modo de entrega para aplicações in vivo.

Para ultrapassar estas limitações, vários grupos de pesquisa está aplicando novos métodos de processamento para gerar formatos de andaime personalizadas, usando tecidos descelularizados como um material de base. Na forma mais simples, isto pode envolver cryomilling os tecidos descelularizados, para gerar partículas de ECM específicos de tecido ¹¹ injectáveis. Estas partículas de ECM podem ser incorporados como uma célula-instrucomponente ctive em suportes de compito com outros biomateriais, tais como in situ reticulação hidrogéis ^{12, 13, 14.} Além do processamento mecânico, tecidos descelularizados podem também ser submetidos a digestão enzimática com proteolítica e / ou enzimas glicolíticas para fabricar hidrogéis derivados de ECM, as espumas, os microtransportadores, e os revestimentos ^{15, 16, 17,} bem como para sintetizar bioinks para impressão em 3D ^18.

Além das aplicações engenharia de tecidos, bioscaffolds derivados do ECM possuem um grande potencial para a geração de maior fidelidade modelos in vitro para a pesquisa biológica. Existe uma necessidade significativa de desenvolvimento de sistemas de cultura de células em 3D que melhor recapitulam o microambiente celular nativo ^19. Mais in vitro cell estudos de cultura, até à data são conduzidas em polistireno para cultura de tecidos (TCPS), que tem pouca relação com o meio celular biologicamente complexo e dinâmico encontrado no interior de tecidos vivos ^20. Embora conveniente para o estudo de interacções celulares no interior de um ambiente controlado, a cultura de células nestes substratos rígidos 2D simplificados altera a fixação das células e da morfologia, assim como ambos célula-célula e célula-ECM interacções ^{21, 22.} As adaptações celulares observados em 2D TCPS pode impactar vias de sinalização intracelular que regulam a diversas funções celulares, incluindo a sobrevivência, proliferação, migração, e diferenciação, levantando questões da relevância dos estudos 2D em modelagem em sistemas in vivo ^23. Tem havido reconhecimento crescente de que o comportamento celular pode variar grandemente em 2D contra sistemas 3D ^24, e que bioquímica e bisinalização omechanical com a ECM são mediadores chave da função da célula ^25. Muitos grupos tentaram ultrapassar as limitações dos sistemas 2D estabelecidos por revestimento TCPS com componentes da matriz extracelular tais como colagénio, laminina e fibronectina. Embora estas estratégias possam melhorar a fixação das células e podem alterar as respostas celulares, estes modelos continuam a ser limitados pela sua configuração 2D que não imita a organização espacial complexo ou bioquímica do ECM nativo ^{26, 27.}

O nosso laboratório bioengenharia tem interesse no desenvolvimento de bioscaffolds derivado de ECM como substratos para as aplicações de cultura de células e tecido de engenharia-3-D. Em particular, nós foi pioneiro no uso de tecido adiposo descelularizado (DAT) como uma plataforma para andaime adiposo regeneração ^28. Além disso, nós estabelecemos a métodos para sintetizar os microtransportadores 3D e espumas porosas usando DEM digerido com a enzima pepsina proteolica ou enzima glicolítica α-amilase ^{29, 30, 31.} Notavelmente, demonstrámos em todos estes formatos de andaime que a ECM derivadas de tecido adiposo fornece um microambiente indutiva para a diferenciao adipogica das células humanas derivadas de tecido adiposo haste / estroma (ASC) em cultura. Mais recentemente, estendemos nossos métodos de fabricação para gerar espumas 3D porosas de porcino α-amilase digerido descelularizados ventrículo esquerdo (DLV) (métodos de decelularização adaptados de Wainwright et ai. ^32), e mostrou que eles proporcionam uma plataforma de suporte para induzir cardiomiogênico precoce expressão do marcador na ASC derivados de gordura de pericárdio humanos ^31.

Este artigo descreve em pormenor os métodos para a síntese de não-reticuladas quimicamente espumas porosas 3D e microtransportadores derivados puramentea partir de ECM α-amilase digerido para utilização como 3D biologicamente complexo em substratos de cultura celular in vitro e como biomateriais para regeneração de tecidos. Em teoria, qualquer fonte de ECM contendo colagénio de elevado peso molecular pode ser utilizado como o material de partida para estas técnicas. Para demonstrar a flexibilidade desta abordagem, os métodos foram aplicados para gerar bioscaffolds específicos de tecidos usando DAT humano, porcino descelularizado tecido dérmico (DDT) ^8, e DLV porcino como exemplos representativos. A Figura 1 proporciona uma visão global do processo de fabrico para as espumas e os microtransportadores derivado de ECM.

Figura 1. Resumo do Método para a produção de espumas e microtransportadores derivado de ECM específicos de tecidos. Desacel 1. tecidos descelularizados, preparado seguindo estabelecidalularization protocolos, pode ser usado para a fabricação de derivados de ECM bioscaffold específico do tecido. Imagens macroscópicas são mostrados de DAT humano hidratado (preparado como descrito no Flynn 2010 ^28), DDT porcino (preparado como descrito no Reing, JE, et al. 2010 ^8), e porcino DLV (preparado como descrito em Wainwright et al. 2010 ³² ), como exemplos representativos de fontes de ECM que podem ser usados ​​como materiais de partida. As barras de escala representam 3 cm. 2. Os tecidos descelularizados são liofilizadas, e, em seguida, 3. triturada mecanicamente. As barras de escala representam 1 cm. 4. O ECM picada pode então ser cryomilled, que é opcional para a fabricação de espuma, mas necessária para a síntese de microtransportador. A barra de escala representa 3 mm. 5. O ECM picada ou cryomilled é então digerido com α-amilase e homogeneizada para criar uma suspensão homogénea de ECM. A barra de escala representa 1 cm. <strong> 6a) Para a fabricação de espuma, a suspensão de ECM é transferida para um molde definido pelo utilizador, congeladas, e liofilizadas para gerar um andaime 3D poroso com uma geometria bem definida. A barra de escala representa 1 cm. 6b) Para a fabricação microtransportador, a suspensão é de ECM cryomilled de electrospray para gerar microtransportadores esféricas discretas. A barra de escala representa 2 mm. 7. As espumas e os microtransportadores pode, então, ser gradualmente re-hidratadas e semeadas com células. Imagens representativas são mostrados de ASC humanos (células viáveis ​​= verde) semeadas na forma de uma espuma DAT (esquerda) e DAT microtransportador (direita). As barras de escala representam 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Processamento do tecido descelularizado Decelularização e liofilização Decellularize tecido (s) de interesse no seguimento de um protocolo estabelecido. NOTA: Os andaimes no presente estudo foram preparados seguindo protocolos publicados para decelularização DAT humano 28, DDT 8 porcino e porcino DLV 32. Comercialmente disponível, o colagénio insolúvel, também pode ser utilizado para fabricar as espumas e os microtransportadores, tais como o colagénio de tendão bovino de origem, que tem sido utilizado com sucesso sobre uma gama de concentrações de 10 – 50 mg / mL. Outras fontes de colagénio insolúveis podem ser utilizados, mas podem requerer optimização para identificar a gama de concentração que produzirá andaimes estáveis. Transferir o tecido descelularizado hidratado ou colagénio purificado para um tubo de centrífuga de 50 mL com uma pinça e adicionar suficiente de água bidestilada (ddH2O) para submergir o tecido, tOA volume total máxima de 35 mL. Congelar a amostra durante a noite a -80 ° C, com o tubo de centrífuga posicionado horizontalmente durante o congelamento para maximizar a área de superfície para a sublimação durante a liofilização subsequente. Remover a tampa do tubo de centrífuga e transferir a amostra congelada em um frasco de liofilização. Liofilizar a amostra usando um liofilizador de laboratório durante 48 – 72 horas ou até estar completamente seca. NOTA: O tempo de secagem pode variar para diferentes liofilizadores e tecidos descelularizados. Finamente mediu a ECM liofilizado em pedaços pequenos (~ 1 – 2 mm 3) usando tesouras cirúrgicas afiadas. Armazenar o ECM picada num secador até que esteja pronto para processamento posterior. NOTA: Recomenda-se que o ECM picada ser usado imediatamente para evitar a absorção de umidade do ambiente. Cryomilling (opcional para a fabricação de espuma) Encher uma câmara de moagem de aço inoxidável de 25 ml para um laboratósistema de ry moinho de bolas com ECM liofilizado picado e adicione duas esferas de moagem de aço inoxidável de 10 mm. Fechar e submergir completamente a câmara de moagem carregado em azoto líquido durante 3 min. Moer a amostra congelada durante 3 min a 30 Hz (1800 rpm). Repita os passos 1.2.2 e 1.2.3 até que a ECM é moída num pó fino. NOTA: O número de vezes que esses passos devem ser repetidos podem variar entre as fontes de ECM. Por exemplo, DAT tipicamente requer 3 ciclos de fresagem para gerar um pó fino. Transferir o pó usando uma scoopula para um frasco de vidro, selar hermeticamente, e armazenar num exsicador. Preparação ECM Suspensão Pesam-se 250 mg de qualquer um picada (para espumas) ou (cryomilled para espumas ou microtransportadores) ECM e transferi-lo para um tubo de centrífuga de 15 mL. Consulte a etapa 1.1.6 e 1.2 para a preparação de ECM picada e ECM cryomilled, respectivamente. NOTA: Este protocolo é concebido para preparar um 50 mg / ml de ECM suspension, que é recomendado para DAT humana, DDT suína e suína DLV. Dependendo da fonte de ECM específico, suspensões uniformes podem ser gerados em concentrações iniciais mais elevadas ou mais baixas. Adicionar 5 ml de 0,22 M de NaH 2 PO 4 (pH 5,4) tampão ao tubo de centrífuga e marcar o nível do líquido no tubo. Prepara-se uma solução estoque α-amilase pela adição de 7,5 mg de α-amilase de 1 ml de 0,22 M de NaH 2 PO 4 (5,4 de pH) tampão. Adicionar 100 ul da solução de estoque α-amilase (0,75 mg de α-amilase; 0,3% w / w de tecido seco) para a amostra. Adicione 0,22 M de NaH 2 PO 4 para se obter um volume final de 10 mL. Agita-se a suspensão continuamente a 300 rpm durante 72 h à temperatura ambiente. Centrifugar a suspensão a 1500 xg durante 10 min. Cuidadosamente recolher e descartar o sobrenadante sem perturbar o pelete de ECM digerido. Ressuspender o material sedimentado em 10 mL de NaCl a 5% diluído em ddH 2 O. Repetir o passo 1.3.5 para um total de duas lavagens com NaCl a 5% em ddH 2 O. Descartar o sobrenadante e ressuspender o material sedimentado em 10 ml de ddH 2 O. Agita-se a suspensão continuamente a 300 rpm durante 10 min a RT. Centrifugar a suspensão a 1500 xg durante 10 min. Cuidadosamente recolher e descartar o sobrenadante sem perturbar o pelete de ECM digerido. Adicionar ácido acético 0,2 M para a marca de 5 ml feita no passo 1.3.2. Agita-se a suspensão continuamente a 120 rpm O / N a 37 ° C. Homogeneizar a suspensão ECM à temperatura ambiente em intervalos de dez segundos utilizando um homogeneizador portátil equipado com uma sonda de largura de dente de serra 10 milímetros até que não há fragmentos permanecem visíveis. Colocar a suspensão num copo de água fria entre os intervalos de homogeneização para evitar o sobreaquecimento. NOTA: Dependendo da fonte de ECM, mais diluição em ácido acético 0,2 M pode ser necessária para se obter uma suspensão homogénea. Excessive arrefecimento da suspensão de ECM podem resultar num aumento da viscosidade que pode interferir com homogeneização eficiente. Se um aumento na viscosidade é de notar, a amostra pode ser reaquecida a 37 ° C e submetido a processamento adicional. Armazenar a 4 ° C durante até um mês antes de espuma ou de fabricação microtransportador. 2. Fabrico da espuma derivada de ECM Incubar a suspensão ECM do passo 1.3.13 (picada ou cryomilled) a 37 ° C com agitação contínua a 120 rpm até que a suspensão é quente. Dilui-se a suspensão em ECM acético 0,2 M ácido para a concentração desejada. NOTA: Dependendo da fonte de ECM, espumas estáveis ​​podem ser preparadas na gama de 10 – 100 mg / mL, com 15-50 mg / mL como a gama recomendada para a DAT, DDT e DLV. Tipicamente, as espumas fabricadas em concentrações mais elevadas serão ligeiramente menos poroso mas mais estável em cultura e mais fácil de manusear. Utilizando uma seringa de 3 ml wom uma agulha de 18 G para evitar a formação de espuma na suspensão de ECM, encher o molde desejado com a suspensão de ECM. Para fabricar o DAT, DDT, e espumas DLV, dispensar 400 uL de 35 mg / mL de suspensão de ECM em uma placa tratada de cultura de células de 48 poços. NOTA: A forma do molde seleccionado e o volume de suspensão MEC vai determinar a geometria da espuma resultante. Cobrir e congelar os moldes durante a noite, colocando-os em uma temperatura de -20 ° C ou -80 ° C congelador. NOTA: A temperatura de congelamento pode afectar a porosidade das espumas. Poros maiores são esperados quando as amostras s congeladas a -20 ° C, em comparação com -80 ° C, devido à formação de grandes cristais de gelo 33. Para fabricar as espumas com uma estrutura porosa uniforme, assegurar que o molde não está em contacto com uma superfície condutora, para evitar um arrefecimento direccional. Colocar os moldes contendo as amostras congeladas num frasco de liofilizao. Ligue o balão liofilizador para o Laboratsistema de secador por congelação ory e seco durante 24 h. NOTA: É importante que a amostra permanece congelado antes da liofilização. Armazenar as espumas liofilizados num exsicador até serem necessárias. 3. Fabrico microtransportador derivado de ECM através electrospraying NOTA: Uma visão geral do electrospraying configuração é mostrado na Figura 2. Incubar a suspensão ECM cryomilled do passo 1.3.13 a 37 ° C com agitação contínua a 100 rpm O / N. NOTA: Cryomilled ECM é utilizado para fabricar os microtransportadores derivado de ECM para garantir uma maior uniformidade na suspensão e evitar o entupimento durante electrospraying. Carga 3 mL de suspensão de ECM em um mL Luer da seringa de fechadura 3 e anexar uma infusão alado definido para o furo da seringa. NOTA: Uma gama de calibres de agulha pode ser utilizada, que reconhece que a selecção pode influenciar o tamanho e forma dos microtransportadores resultantes. para fabricate os microtransportadores DAT, DDT, e DLV, usar uma agulha G 25. Fixe a seringa dentro da bomba de seringa. Prender a agulha a uma estante de retorta e posicionar a ponta da agulha verticalmente a uma distância de 4 – 6 cm do topo de um frasco Dewar baixo-forma (250-500 gama de tamanho mL recomendado). Anexar um eléctrodo de crocodilo grampo para a ponta da agulha e ligá-la ao terminal positivo da fonte de alimentação de alta tensão. Dobrar uma tira de folha de alumínio (12 x 5 cm), ao longo da borda da garrafa de vácuo. Anexar um segundo eléctrodo de crocodilo grampo para o bordo exterior da folha e ligá-la ao terminal de fonte de terra da fonte de alimentação. Encher o frasco de Dewar com azoto líquido a cerca de 1 cm a partir do topo, de modo que ¾ da película é submersa. NOTA: É importante manter o frasco Dewar cheio com azoto líquido. A superfície do azoto líquido deve ser inferior a 2 cm a partir do topo do frasco durante o proces electrosprayings. reabastecimento contínuo do azoto líquido é necessária para manter um nível constante durante electrospraying. Definir a bomba de seringa a uma taxa de infusão de 30 ml / h. NOTA: A variação da taxa de infusão pode alterar a forma microtransportador e diâmetro, mas a gama recomendada é de 25 – 35 ml / h. Embora seja altamente dependente da viscosidade da suspensão, as taxas de fluxo inferiores a 25 mL / h pode resultar na geração de microtransportadores maiores. Para caudais muito baixos, o tamanho e forma dos microtransportadores pode ser menos homogénea. Em taxas de infusão acima de 35 mL / h, a uniformidade das gotículas geradas através electrospraying pode ser interrompido, resultando em microtransportadores não esféricas com uma distribuição de tamanho mais larga 34. Aplicar uma tensão de 20 kV e ligue a bomba de seringa para iniciar electrospraying. NOTA: A tensão pode ser variada para ajustar o tamanho dos microtransportadores e tende a ter um impacto maior sobre o diâmetro do que o infusiotaxa n. A faixa de voltagem recomendada é 15 – 25 kV. Uma diminuição no diâmetro microtransportador é esperado com um aumento na tensão 35. Uma vez que a infusão é completa, verter cuidadosamente o excesso de azoto líquido a partir do vaso Dewar, deixando os microtransportadores suspensos em ~ 25 ml de azoto líquido para garantir que eles permanecem congeladas. transferir imediatamente os microsuportes com o azoto líquido para um tubo de centrífuga de 50 mL por vazamento em um movimento suave. Recolher qualquer microcarregadores congelados remanescentes no Dewar com um scoopula e adicioná-los ao tubo de centrífuga. NOTA: Dependendo do tamanho do vaso Dewar, os microtransportadores em azoto líquido pode ser inicialmente vertida para um recipiente de tamanho médio, e, em seguida, transferido imediatamente para dentro do tubo de centrífuga de 50 mL. Cobrir o tubo de centrifugação contendo os microtransportadores em azoto líquido com uma folha de alumínio perfurada com pequenos orifícios, em preparação para a liofilização. Coloque a centrífuga cobertatubos para um balão liofilizador. ligar imediatamente o frasco para o liofilizador e secar as amostras S / N. NOTA: É muito importante para manter os microtransportadores em suspensão em azoto líquido, para garantir que eles não descongelar antes desta etapa, tal como a descongelação pode resultar em colapso e / ou agregação. DAT, DDT e DLV microtransportadores fabricadas com uma concentração de 35 mg / mL utilizando as condies descritas acima electrospraying terá tipicamente um diâmetro hidratado variando entre 350-500? M em tamanho. A distribuição de tamanho pode variar dependendo da fonte de ECM. Armazenar os microcarregadores liofilizados num exsicador até serem necessárias. Figura 2. Vista geral do Aparelho electrospraying utilizado em microtransportador fabricação. A: Imagem que mostra o arranjo do equipamento fundamental electrospraying incluindo a bomba de seringae fonte de alimentação de alta tensão, assim como o posicionamento da agulha em relação ao Dewar de azoto líquido. B: electrospraying esquemática, incluindo as gamas recomendadas para a tensão, a taxa de infusão, e a distância. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 4. Espumas preparação e Microcarregadores para cultura de células Reidratação Transferir as espumas liofilizadas com uma pinça para um tubo de centrífuga de 50 mL contendo o excesso de etanol absoluto (~ 99,9%) (~ 5: 1 de etanol para espumas). Da mesma forma, ressuspender os microtransportadores liofilizadas em excesso de etanol absoluto dentro do tubo de centrifugação original utilizado para a recolha. Usando uma pipeta serológica, filtrar os microtransportadores através de um peneiro de aço inoxidável com um tamanho de malha definidos para um novo tubo de centrífuga de 50 ml para remover quaisquer agregados e seleccionar para gamas de tamanho desejadas. NOTA: Se as espumas são fabricadas dentro de placas TCPS, eles podem ser re-hidratados directamente dentro destes vasos. Incubar a 4 ° C durante 4 h ou até que as espumas ou microtransportadores ter gravidade assentado no fundo do tubo de centrifugação. Executar todos os passos subsequentes de uma câmara de fluxo laminar utilizando reagentes estéreis e técnica asséptica apropriada. Remover o etanol absoluto, utilizando uma pipeta serológica e adicionar um excesso de (5: 1 ratio) etanol a 95% diluído com solução salina de fosfato estéril tamponado (PBS) para os andaimes. Incubar a 4 ° C durante 4 h ou até que os andaimes derivado de ECM ter afundado até o fundo do vaso de re-hidratação. Gradualmente reidratar os andaimes por meio de uma série de etanol (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 e 0%, diluída com PBS estéril). Em cada passo, incubar a 4 ° C até os andaimes ter afundado até o fundo do recipiente antes de mudar a solução. Desgaseificar as andaimes sob vácuo luz se a formação de bolhas no interior dos andaimes é observed. Substituir o PBS estéril para um período adicional de duas lavagens para remover o etanol residual. Armazenar em 100% de PBS estéril, a 4 ° C até estar pronto para a cultura de células. Use os andaimes dentro de 1 – 2 semanas após a reidratação. Preparação para Sementeira celular No dia antes da sementeira, transferir as espumas usando uma pinça em cultura de células assim tratadas placas ou inserções Transwell e adicionar meio de cultura celular suficiente (seleccionados com base no tipo de cula de interesse) para submergir completamente os suportes (por exemplo, 2,5 ml / andaime em uma placa de 12 poços). Do mesmo modo, permitir que os microtransportadores para resolver gravidade dentro do tubo de centrifugação, cuidadosamente remover o PBS utilizando uma pipeta serológica sem perturbar os microtransportadores, e adicionar meio de cultura celular para atingir uma relação de 5: 1 de meio aos microtransportadores. NOTA: Para semear ASC humanos, utilizar Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM): mistura nutriente F12 de Ham suplementado com10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina. Substituir o meio de cultura de células para um total de um enxaguamento. Equilibra-se durante a noite a andaimes em meio de cultura de células a 37 ° C. Os andaimes estará pronto para celular semeadura no dia seguinte. NOTA: As espumas podem ser estaticamente cultivadas em insertos de culturas celulares ou de cultura de tecidos bem placas 29, ou dinamicamente semeados usando um agitador de laboratório de 36. Dependendo da fonte de ECM, métodos de transformação e da concentração da suspensão, a semeadura dinâmico podem melhorar a fixação celular inicial, a proliferação e a infiltração. Os microcarregadores podem ser semeadas dinamicamente usando um sistema de cultura giratório 11.

Representative Results

No presente estudo, nós fabricado espumas e microtransportadores derivado de ECM usando DAT humana, o DDT porcino e porcino DLV como exemplos representativos demonstram que as técnicas podem ser aplicadas para gerar bioscaffolds específicos de tecido, utilizando uma variedade de tecidos descelularizados como fontes de ECM ( A Figura 1). Para ambos espuma e microtransportador fabricação, a técnica Nishihara de solubilização do colagénio com a enzima glicolítica α-amilase 37 foi adaptada para gerar uma suspensão de ECM viscoso a partir dos materiais de tecido de partida descelularizados, que é usado para sintetizar os bioscaffolds através de procedimentos de congelamento e de liofilização controladas. Para fabricar as espumas, os tecidos descelularizados podem ser processados ​​por meio de qualquer picagem mecânica ou cryomilling para aumentar a área de superfície antes da digestão enzimática. Segue45; da a-amilase e o tratamento de homogeneização, a suspensão resultante ECM é dispensado num molde definido pelo utilizador, que é em seguida congelada e liofilizada. Os suportes podem ser armazenadas de forma estável num estado seco durante um período de tempo prolongado. Antes de ser utilizado em estudos de cultura de células, os andaimes liofilizados devem ser submetidos a um processo de re-hidratação controlada que produz espumas porosas homogéneos e altamente hidratadas derivados de ECM puro (Figura 3A). Se as espumas são reidratadas muito rapidamente, inchaço rápido pode danificar características estruturais delicadas, resultando em perda de integridade e colapso estrutural. Em geral, as espumas irá reter a forma definida pelo molde seguinte re-hidratação original e são estáveis ​​sem a necessidade de reticulação química. A Figura 3B mostra representativa de microscopia electrónica de varrimento (SEM) imagens do DAT, DDT, e DLV espumas fabricadas com ECM cryomilled a uma concentração de 35 mg / ml e uma temperatura de congelação de -80 & #176; C. Figura 3. As imagens representativas do DAT, DDT, e DLV Espumas fabricado com Cryomilled ECM Suspensões com uma concentração de 35 mg / mL e congelou-se a -80 ° C. A: vista macroscópico do DAT, DDT, e DLV branqueado espumas sintetizados num molde de placa de cultura de tecido de 48 poços a seguir re-hidratação. As barras de escala representam 1 cm. B: As imagens SEM das espumas DAT, DDT, e DLV mostrando uma ultra-estrutura porosa homogénea. As barras de escala representam 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. As suspensões de ECM cryomilled também pode ser usado para gerar os microtransportadores derivado de ECM puros através de técnicas electrospraying (Figura 2 </strong>). Para cada fonte de ECM, a concentração da suspensão, calibre da agulha, a taxa de infusão, e de tensão pode ser ajustado para gerar microtransportadores esféricas discretas que variam 350-500 um de diâmetro seguindo re-hidratação controlada (Figura 4A). Enquanto os microtransportadores podem ser armazenadas num estado liofilizado, recomenda-se para facilidade de manuseamento que eles são dispensados ​​ou peneirado para uma gama de tamanhos desejada seguinte ressuspensão em etanol. SEM de imagem sugere que a ultraestrutura microtransportador pode variar dependendo da fonte de tecido descelularizado (Figura 4B). Figura 4. Imagens representativas do DAT, DDT, e DLV microtransportadores fabricado com Cryomilled ECM Suspensões com uma concentração de 35 mg / mL, uma Taxa de infusão de 0,5 ml / min, e uma voltagem aplicada de 20 kV. A: macroscópica vista of os microtransportadores hidratados DAT, DDT, e DLV. As barras de escala representam 4 mm. B: imagens de SEM dos microtransportadores DAT, DDT, e DLV mostrando que a ultra-estrutura e tamanho pode variar dependendo da fonte de ECM. As barras de escala representam 100 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. As propriedades mecânicas dos andaimes são dependentes da fonte de ECM, o método de processamento aplicado (ou seja, contra picagem cryomilling), a concentração da suspensão de ECM, e a temperatura de congelação. Em geral, os andaimes são macio e complacente, com módulos de Young na gama de 1-5 kPa relatado para o DAT (50 & 100 mg / mL) 29 e espumas DLV (20 – 50 mg / mL) 31, e <1 kpa para os microcarregadores. as espumas cryomilled são tipicamente mais suave thuma das picada, devido à sua natureza interrompido. sistemas de ensaio mecânicas especializadas equipados com células carga altamente sensíveis necessários a caracterização precisa propriedades compressivas. tipicamente, e microtransportadores teria módulos baixos do que tecidos descelularizados nativa, aos passos processamento adicionais envolvidas na fabricação, incluindo digestão enzimática homogeneização, bem como não-covalentemente reticulado dos andaimes. no entanto, isso pode variar dependendo tecido interesse. por exemplo, em trabalhos anteriores, verificou-se picada dat fabricadas altas concentrações ecm (100 mg >

Discussion

Em geral, bioscaffolds derivadas de tecidos descelularizados podem aproximar-se mais da composição 3D complexo e estrutura de ECM no micro-ambiente celular nativo, em comparação com andaimes sintéticos ou modelos de cultura padrão com base em 2D TCPS. Como discutido anteriormente, as interacções célula-ECM são criticamente importantes na mediação de comportamento celular, tanto em cultura e no corpo ^1. Reconhecendo que as propriedades bioquímicas, biofísicas e biomecânicas do ECM são únicos para cada tecido, há cada vez mais evidências para apoiar a justificativa para a aplicação de abordagens de tecidos específicos no projeto de biomateriais para a engenharia de tecidos, bem como no desenvolvimento de mais Os modelos de cultura fisiologicamente relevantes para experiências in vitro ^20. Utilizando tecidos descelularizados como um material de partida, os nossos métodos pode incorporar a composição complexa da ECM específica de tecido dentro de mais custformatos de andaime omizable. Enquanto os passos de processamento mecânico e enzimáticas irá resultar numa perda da ultra-estrutura ECM nativa, estudos anteriores com o DAT demonstraram que os efeitos instrutivos do ECM derivadas de tecido adiposo s conservados nestes formatos de andaime, sugerindo que a composição bioscaffold é um mediador chave da função das células ^{11, 29.} Uma vantagem significativa da utilização das espumas e microtransportadores derivado de ECM como substratos de culturas de células, em comparação com os tecidos descelularizados intactas é que eles são mais homogénea, o que pode melhorar a uniformidade na distribuição celular e as interacções célula-célula / célula-ECM.

Os métodos descritos aqui podem ser utilizados para gerar uma ampla gama de bioscaffolds específicos de tecidos para utilização em cultura de células e aplicações de engenharia de tecidos. Por exemplo, além do DAT, DDT, e DLV, nosso laboratório tem aplicado com sucesso estas técnicas para gerar POR 3Despumas ous usando osso descelularizado, cartilagem, núcleo pulposo, e fibrose do anel, bem como comercialmente disponível, o colagénio insolúvel derivada de tendão bovino. A partir de uma perspectiva in vitro, estes bioscaffolds poderia ser utilizado como uma base para a maior fidelidade-modelos de cultura 3D para investigar Cellular Biology, fisiologia ou patologia da doença ^38, como substratos bioactivos em high-throughput plataformas de rastreio de fármacos ^39, ou matrizes como instrutiva para haste diferenciação ^{40, 41} células. DAT, DDT e DLV espumas fabricadas em concentrações de 25 – 50 mg / mL são estáveis a longo prazo na cultura in vitro (testado até 28 dias). Além disso, todos os três tipos de microtransportadores podem suportar a ligação de células e proliferação sob condições dinâmicas, em um sistema de cultura em balão giratório de baixo-corte (10 – 15 rpm) durante, pelo menos, 2 semanas. Para aplicações in vivo, o biocompatível e biodegradaespumas e microcarregadores derivados do ECM ble uma promessa como produtos off-the-shelf para estimular a remodelação do tecido construtiva e regeneração ^{11, 29.} Além disso, os suportes de célula-adesivo poderia ser usado como sistemas de entrega de terapia celular ^{42, 43.} A título de exemplo, espumas de DAT foram mostrados para promover a angiogénese e a adipogénese quando semeados com ASC alogénicos e implantado por via subcutânea num modelo de rato ²⁹ imunocompetente. Relativamente ao DAT intacta, o DAT mais altamente processados ​​espumas degradada muito mais rapidamente, com uma redução de 50% no volume observado em 3 semanas em que se tornou integrado com os tecidos do hospedeiro, e quase completa reabsorção por 12 semanas. No entanto, as espumas também induziu uma resposta angiogénica mais potentes, o que sugere que a ECM digerido por enzimas teve efeitos pró-regenerativos exclusivos. Da mesma forma, os microtransportadores derivado de ECM podem ser utilizados como in vitro </ em> substratos de cultura de células dentro de sistemas de cultura de dinâmicos e como veículos de distribuição de célula injectáveis ^{11, 30, 44.} Mais especificamente, o pequeno diâmetro e grande área superficial dos microtransportadores pode permitir a entrega de uma grande quantidade de células num volume pequeno, ao mesmo tempo proporcionar uma matriz que pode ajudar a suportar a viabilidade das células e aumentar a retenção de células no local da injecção ^30. Antes de ser utilizado em qualquer sistema vivo, é essencial para assegurar que a fonte de ECM é substancialmente desprovida de componentes celulares antigénicas e / ou reagentes de decelularização potencialmente citotóxicos que poderiam provocar uma resposta do hospedeiro negativo ^7.

A enzima pepsina proteolica é vulgarmente utilizado na preparação de hidrogeles derivado de ECM ^15. A pepsina é uma protease não específica que irá digerir proteínas de colagénio e outros ECM intO pequenos fragmentos ^45. Enquanto hidrogéis fabricadas a partir de ECM digerida com pepsina foram referidos como tendo efeitos em células-instrutivo, uma limitação é a de que estes materiais tendem a ser extremamente mecanicamente fraco ^46. No nosso desenvolvimento inicial dos microtransportadores DAT, que utilizou uma abordagem compósito em que a pepsina-digerido DAT foi combinado com alginato e adicionado gota a gota em _CaCl2 para formar grânulos esféricos ^30. As esferas foram subsequentemente foto-reticulado e o alginato foi extraído utilizando citrato de sódio. Além do requisito para a reticulação química, uma limitação importante foi que os microtransportadores fabricadas com esta abordagem tinha fraca estabilidade abaixo de uma gama de tamanhos de 900-950? M ^30. Em lugar de pepsina, os métodos aqui apresentados utilizam uma digest mais suave do ECM com a enzima glicolítica α-amilase, que é postulada para clivar os grupos de hidratos de carbono a partir do telopeptide regiões de colagénio, aumentando assim a solubilidade em ácido acético a ^37. Esta abordagem permite o isolamento de colagénio altamente polimerizada que pode ser usado para gerar espumas e microtransportadores derivado de ECM puros sem a necessidade de reticulação químico ou outros aditivos. Estes bioscaffolds são estabilizadas através de interacções físicas e de ligação de hidrogénio entre as fibrilhas de colagénio bem conservados, semelhante à do colagénio no microambiente ECM nativa.

As espumas são uma plataforma altamente flexível, que pode ser fabricado numa grande variedade de geometrias, dependendo do molde específico seleccionado. Para os estudos de cultura de células, as espumas podem ser moldados directamente em placas de poços TCPS, para formar revestimentos ou suportes 3D de espessura variável. Para fabricar as espumas 3D com superfícies muito uniformes, recomenda-se que um molde é desenhado que pode ser vedado em ambos os lados com plástico ou lâminas de vidro. De qualquer ECM picada ou cryomilled pode ser utilizado para sintetizaras espumas. Em geral, verificou-se que as espumas cryomilled tendem a ser macroscopicamente mais macio e tem uma ultra-estrutura mais interrompido em concentrações mais baixas ^{31, 36.} Dependendo da fonte de tecido, os passos adicionais de processamento mecânico pode causar alterações na composição ECM que poderia ter impacto função celular. Por exemplo, no nosso trabalho anterior, laminina foi detectado em espumas DLV picada, mas não cryomilled DLV espumas ^31. Em contraste, colagénio I, colagénio IV, laminina, fibronectina e foram detectadas tanto em picada e cryomilled DAT espuma ^36. Para além das etapas de processamento mecânico, o tamanho de poro e porosidade das espumas pode ser sintonizada em certa medida através da variação da concentração da suspensão de ECM e a temperatura de congelação ^47. Em geral, as espumas de concentração mais baixos (~ 10 – 15 mg / mL) são qualitativamente mais porosa, mas pode contrair rapidamente e têm uma fracaestabilidade em cultura a longo prazo ^{31, 36.} Do mesmo modo, uma taxa mais lenta de congelamento, tipicamente, conseguida por uma temperatura de congelação mais elevada, pode resultar em poros maiores nas espumas devido ao tamanho dos cristais de gelo formados durante a fabricação ^29. Todos estes parâmetros podem influenciar as interacções das células com os materiais, incluindo a fixação, infiltração, e remodelação. Por exemplo, o crescimento celular em espumas que são fabricados com concentrações mais elevadas de ECM podem ser limitados às regiões de superfície, particularmente com fontes de ECM picados e sob condições de cultura estáticos ^36.

Para os microtransportadores, os principais parâmetros que podem ser sintonizados são a concentração da suspensão de ECM, calibre de agulhas, e tensão aplicada, com concentrações mais elevadas, tipicamente originando microtransportadores que são mais estáveis ​​sob cultura dinâmica de longa duração. Após o início do electrospraying, os suspens ECMgotículas de iões deve cair rapidamente para o centro da garrafa, no sentido da direcção do colector de folha de alumínio. Para prevenir a agregação, é importante que as pérolas em contato com o azoto líquido, antes da folha. A distância entre a agulha e a superfície do azoto líquido pode ser ajustada para satisfazer estes requisitos. É importante notar que a optimização pode ser necessária, dependendo das propriedades de cada fonte de ECM específico, em particular, na selecção da gama de concentração que irá gerar bioscaffolds estáveis. Outro factor chave é o protocolo de descelularização que é usado para gerar os materiais de partida, como métodos de decelularização que degradam a ECM ou na presença de reagentes residuais (por exemplo, surfactantes) podem ter um impacto negativo na estabilidade das espumas resultantes e microtransportadores. Se os desafios são encontrados com estabilidade bioscaffold, opções que podem ser investigados incluem o uso de um processo de reidratação mais gradual, aumentando a susp ECMconcentração ension, e explorando picada contra ECM cryomilled. Caso todas essas opções não conseguem resolver o problema, pode ser necessário para explorar alternativa protocolos de decelularização ou fontes de ECM.

Para assegurar a reprodutibilidade durante a produção de andaime, cuidados especiais devem ser tomados em determinadas etapas do protocolo. Quando cryomilling os tecidos descelularizados, recomenda-se que a moagem ser realizada imediatamente após a liofilização num ambiente seco para reduzir a possibilidade de agregação das partículas, devido à absorção de humidade a partir do ambiente. Durante o fabrico microtransportador, sugere-se que a suspensão é de electrospray em pequenos lotes, com um volume máximo de 3 mL, para evitar problemas com o arrefecimento da amostra que podem resultar na obstrução da agulha. Além disso, é essencial que os microcarregadores não têm permissão para descongelar após o processo de electrospraying. Para manter a sua geometria esférica e a estabilidade mecânica, a microcarriers deve ser recolhida a partir do azoto líquido, transportado num recipiente cheio de azoto luido, e imediatamente liofilizados. Finalmente, para ambos os espumas e os microtransportadores, é fundamental que os passos de re-hidratação são realizadas lentamente ao longo de um período de vários dias. reidratação rápida pode resultar em colapso estrutural na macro e / ou micro-escala. Além disso, a re-hidratação deve ocorrer lentamente para evitar a formação de pequenas bolhas de ar dentro do andaime, o qual pode exigir uma quantidade significativa de tempo para desgaseificar sob vácuo ligeiro.

Em conclusão, os métodos apresentados no presente documento podem ser utilizados para fabricar uma matriz diversificada de espumas e microtransportadores específicos de tecidos compostos por ECM pura, não-reticulado quimicamente. Uma vantagem para os investigadores biológicos é que os bioscaffolds são fáceis de manusear e pode ser processado similarmente para os tecidos ao realizar análises com técnicas, tais como ensaios de histologia, imuno-histoquímica, ou a expressão de genes e proteínas.Além disso, os andaimes derivado de ECM podem ser degradados enzimaticamente para extrair populaes de culas semeadas, ou pode ser utilizado directamente como veículos de distribuição de célula biodegradáveis ​​e biocompatíveis. No geral, esta tecnologia plataforma flexível tem grande utilidade para várias aplicações, incluindo para os estudos de cultura celular 3D que investigam a função celular, como substratos de expansão celular, e bioscaffolds como pró-regenerativas.

Materials

Acetic acid, glacial	BioShop	ACE222.500
Alligator clip leads	VWR	470149-728
Aluminium foil	Fisher Scientific	01-213-101
a-amylase	Sigma	101074694	from Aspergillus aryzae
Analytical balance	Sartorius	CPA225D
Centrifuge	Thermo Scientific	75004251	With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes
Centrifuge tubes (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Centrifuge tubes (50 mL)	Sarstedt	62.547.205
Collagen from bovine achilles tendon (insoluble)	Sigma	C9879	Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers
Cryomilling system	Retsch	20.745.0001	MM 400
Dessicator	Fisher Scientific	8624426	For lyophilized ECM and bioscaffold storage
DMEM: F12 Hams	Sigma	D6421	Used for proliferation media
Dewar flask	Fisher Scientific	10-196-6	Low form; volume range of 250 – 500 mL
Double distilled water			From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System
D-PBS	Wisent	311425125
ECM			Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Ethanol	Greenfield Specialty Alcohols Inc.	P016EAAN	Absolute
Fetal bovine serum	Wisent	80150	Used for proliferation media
Forceps	VWR	37-501-32	For transferring the foams
Freezer (-20 °C)	VWR	97043-346
Freezer ( -80 °C)	Thermo Scientific	EXF40086A
Glass vials	Fisher Scientific	03-339-26D	To store lyophilized cryomilled ECM
Hand held homogenizer	Fisher Scientific	14-359-251	Speed: 8000 – 30,000 RPM
Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes	Fisher Scientific	14-261-17	10 X 95 mm
Liquid nitrogen			For electrospraying
Lyophilizer	Labconco	7750021	FreeZone4.5
Milling chamber	Retsch	02.462.0213	25 mL volume recommended
Milling balls	VWR	16003-606	10 mm diameter, stainless steel recommended
18G needle	VWR	C ABD305185	For dispensing ECM suspension into moulds
Orbital incubator shaker	SciLogex	832010089999	Temperature controlled (37 °C)
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122	Used for proliferation media
Pipet-Aid XP	Mandel Scientific	DRU-4-000-101
Retort stand	VWR	470019-526
Retort stand clamp	VWR	21573-606
Safety-Lok Syringe	BD	309606	3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension
Serological pipettes (10 mL )	Sarstedt	86.1254.001
Serological pipettes (25 mL)	Sarstedt	86.1685.001
Sodium chloride	BioShop	7647-14-5
Sodium phosphate monobasic	BioShop	10049-21-5
Scoopula	VWR	89259-968	For collecting microcarriers
Surgical scissors	VWR	82027-590
Syringe pump	VWR	10117-490	Microprocessor controlled
High voltage power supply	Gamma High Voltage Research	ES30P-5W/DDPM	Capable of recommended 15 – 25 kV voltage range
12-well plates	Fisher Scientific	12565321	For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected
Winged infusion set	Terumo	22258092	30 cm tubing length, 25 G 3/4 " recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter