La fabricación de espumas y microportadores derivados de la matriz extracelular como específica de tejido de cultivo celular y las plataformas de entrega

Summary

La matriz extracelular específica del tejido (ECM) es un mediador clave de la función celular. Este artículo describe métodos para la síntesis de espumas y microportadores que son estables en cultivo sin la necesidad de reticulación química para aplicaciones en 3D avanzados pt modelos de cultivo celular in vitro o como matrices biodegradables pro-regenerativas puros ECM-derivado.

Abstract

función de las células está mediada por la interacción con la matriz extracelular (ECM), que tiene una composición específica de tejido complejo y la arquitectura. El enfoque de este artículo es sobre los métodos para la fabricación de espumas y microportadores porosos ECM derivado para su uso como sustratos biológicamente relevantes en 3D avanzada pt modelos de cultivo celular in vitro o como andamios pro-regenerativos y sistemas de suministro de células para la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa. El uso de tejidos descelularizados o colágeno insoluble purificada como material de partida, las técnicas se pueden aplicar para sintetizar una amplia gama de matrices biodegradables específicos de tejido con geometrías personalizables. El enfoque implica el tratamiento mecánico y la digestión enzimática suave para producir una suspensión ECM que se utiliza para fabricar las espumas tridimensionales o microportadores a través de procedimientos de congelación y liofilización controladas. Estos andamios puros ECM derivados son altamente porosa, pero estable sin la necesidad de chemical agentes u otros aditivos que pueden afectar negativamente a la función celular de reticulación. Las propiedades de andamios se pueden sintonizar en cierta medida por factores variables tales como la concentración ECM suspensión, los métodos de procesamiento mecánico, o las condiciones de síntesis. En general, los armazones son robustos y fáciles de manejar, y se pueden procesar como tejidos para la mayoría de los ensayos biológicos estándar, proporcionando una plataforma de cultivo de células 3D versátil y fácil de usar que imita la composición ECM nativa. En general, estos métodos sencillos para la fabricación de espumas y microportadores personalizadas ECM derivados pueden ser de interés para ambas biólogos e ingenieros biomédicos como plataformas de células instructivo específicos de tejido para in vitro y pt aplicaciones in vivo.

Introduction

La matriz extracelular (ECM) se compone de una red 3D compleja de proteínas, glicoproteínas y polisacáridos ^1. Una vez considerado como un marco predominantemente estructural, ahora se reconoce bien que el ECM incorpora un conjunto diverso de moléculas bioactivas con importantes papeles funcionales ^2. Las interacciones célula-ECM pueden dirigir la supervivencia celular, adhesión, migración, proliferación y diferenciación ^3. Mientras que las clases principales de macromoléculas de ECM son generalmente bien conservadas a través de tejidos y especies, cada tejido tiene una composición de matriz única y arquitectura ^4. En general, el ECM específico de tejido proporciona un microambiente instructivo que media la función desde el subcelular a la escala de tejido / órgano ^5.

Debido al papel fundamental de la MEC en la mediación de la función celular, existe un interés creciente en el desarrollo de matrices biodegradables ECM derivados para aplicaciones en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa. En particular, el método de la descelularización se ha explorado ampliamente como un medio de obtención de ECM a partir de una amplia gama de tejidos para su uso como un material de andamiaje para la regeneración de tejidos y la entrega celular ^{5, 6, 7.} La descelularización implica típicamente una serie de etapas, químicos, mecánicos y / o biológica de tratamiento dirigidos a la eliminación de células y componentes celulares, mientras que idealmente provocando alteraciones mínimas a la estructura 3D y la composición de la MEC ^8. A través de topografía de la literatura, diversos protocolos de descelularización se pueden identificar para prácticamente todos los tejidos en el cuerpo ^7.

Si bien los tejidos descelularizados se pueden utilizar directamente como andamios implantables o sustratos de cultivo de células 3D, la infiltración celular puedelimitarse en los tejidos con una estructura de ECM densa ^9. Además, la heterogeneidad natural en el ECM puede causar variabilidad en la unión celular y distribución dentro de las matrices descelularizado, que potencialmente podrían afectar la respuesta celular ^10. En general, aunque prometedor para algunas aplicaciones, la aplicación de tejidos descelularizados en su forma intacta ofrece versatilidad limitada en términos de propiedades de sintonización de andamio incluyendo forma, porosidad, y la rigidez, así como el modo de entrega para aplicaciones in vivo.

Para evitar estas limitaciones, numerosos grupos de investigación están aplicando otros métodos de procesamiento para generar los formatos de andamio personalizadas utilizando tejidos descelularizados como material de base. En la forma más simple, esto puede implicar cryomilling los tejidos descelularizados para generar partículas de ECM específicos de tejido inyectables ^11. Estas partículas de ECM se pueden incorporar como una célula-instrucomponente ctive en andamios compuestos con otros biomateriales, tales como in situ hidrogeles ^{12, 13, 14} de reticulación. Además del procesamiento mecánico, tejidos descelularizado también pueden ser sometidas a digestión enzimática con proteolítica y / o enzimas glucolíticas para fabricar hidrogeles ECM-derivado, espumas, microportadores, y los revestimientos ^{15, 16, 17,} así como para sintetizar bioinks para la impresión en 3D ^18.

Además de las aplicaciones de ingeniería de tejidos, matrices biodegradables ECM derivados tienen un gran potencial para la generación de mayor fidelidad pt modelos in vitro para la investigación biológica. Hay una importante necesidad de desarrollar sistemas de cultivo de células en 3D que recapitular mejor el microambiente celular nativa ^19. La mayoría in vitro cELL estudios de cultivo hasta la fecha se llevan a cabo en el cultivo de tejidos de poliestireno (TCPS), que tiene poca correlación con el medio celular biológicamente complejo y dinámico encontrado dentro de los tejidos vivos ^20. Aunque esto es conveniente para el estudio de las interacciones celulares en un entorno controlado, el cultivo de células en estos sustratos 2D rígidos simplificados altera la unión celular y la morfología, así como tanto la célula-célula y célula-ECM interacciones ^{21, 22.} Las adaptaciones celulares observadas en 2D TCPS pueden afectar vías de señalización intracelular que regulan diversas funciones celulares, incluyendo la supervivencia, proliferación, migración y diferenciación, se plantean cuestiones de la relevancia de los estudios 2D en el modelado de sistemas in vivo ^23. Ha habido un creciente reconocimiento de que el comportamiento celular puede variar mucho en comparación con los sistemas 2D en 3D ^24, y que bioquímica y biseñalización omechanical con la ECM son mediadores clave de la función de las células ^25. Muchos grupos han intentado superar las limitaciones de los sistemas 2D establecidos por recubrimiento TCPS con componentes de la MEC tales como colágeno, laminina y fibronectina. Si bien estas estrategias pueden mejorar la unión de las células y pueden alterar las respuestas celulares, estos modelos siguen siendo limitados por su configuración 2D que no imitan la organización espacial compleja o bioquímica de la ECM nativo ^{26, 27.}

Nuestro laboratorio de bioingeniería se ha interesado en el desarrollo de matrices biodegradables derivados de la MEC como sustratos para aplicaciones de cultivo celular y la ingeniería tisular en 3-D. En particular, hemos sido pioneros en el uso de tejido adiposo descelularizado (DAT) como una plataforma de andamio para la regeneración adiposo ^28. Además, hemos establecido métodos para sintetizar microportadores 3D y espumas porosas utilizando DAT digerido con la enzima pepsina proteolítica o enzima glicolítica α-amilasa ^{29, 30, 31.} En particular, hemos demostrado a través de todos estos formatos de andamio que la ECM derivadas de tejido adiposo proporciona un microambiente inductivo para la diferenciación adipogénica de las células humanas derivadas de tejido adiposo de vástago / estroma (ASC) en cultivo. Más recientemente, hemos extendido nuestros métodos de fabricación para generar 3D espumas porosas de porcino digerido con α-amilasa descelulariza ventrículo izquierdo (DLV) (métodos descelularización adaptados de Wainwright et al. ^32), y demostramos que proporcionan una plataforma de apoyo para inducir cardiomiogénico temprano la expresión del marcador en las ASC derivadas de la grasa pericárdicos humanos ^31.

Este artículo describe en detalle los métodos para sintetizar 3D espumas y microportadores porosos no químicamente reticulados derivados puramentede ECM α-amilasa digerido para uso como 3D biológicamente complejo pt sustratos de cultivo celular in vitro y como biomateriales para la regeneración de tejidos. En teoría, cualquier fuente de ECM que contiene colágeno de alto peso molecular se puede usar como el material de partida para estas técnicas. Para demostrar la flexibilidad de este enfoque, se han aplicado los métodos para generar matrices biodegradables específicos de tejido usando DAT humano, porcino descelularizado tejido dérmico (DDT) ^8, y DLV porcino como ejemplos representativos. La Figura 1 proporciona una descripción visual del proceso de fabricación para las espumas y microportadores ECM-derivado.

Figura 1. Descripción general del procedimiento para la producción de las espumas y microportadores ECM derivados específicos de tejido. Deceleración 1. tejidos descelularizado, preparó siguiendo establecidoprotocolos lularization, se pueden utilizar para la fabricación bioscaffold ECM-derivado específico de tejido. Imágenes macroscópicas se muestran de hidratado DAT humano (preparado como se describe en Flynn 2010 ^28), DDT porcino (preparado como se describe en Reing, JE, et al. 2010 ^8), y porcino DLV (preparado como se describe en Wainwright et al. 2010 ³² ), como ejemplos representativos de fuentes de ECM que se pueden utilizar como materiales de partida. Las barras de escala representan 3 cm. 2. Los tejidos descelularizados se liofilizan, y luego 3. picada mecánicamente. Las barras de escala representan 1 cm. 4. El ECM picada puede entonces ser cryomilled, que es opcional para la fabricación de espuma, pero requiere para la síntesis de microportadores. La barra de escala representa 3 mm. 5. El ECM picada o cryomilled se digiere a continuación con α-amilasa y se homogeneizó para crear una suspensión ECM homogénea. La barra de escala representa 1 cm. <strong> 6a) Para la fabricación de la espuma, la suspensión ECM se transfiere a un definido por el usuario molde, congelados, y se liofilizó para generar un andamio 3D poroso con una geometría bien definida. La barra de escala representa 1 cm. 6b) Para la fabricación de microportadores, la suspensión ECM cryomilled se electro pulverizada para generar microportadores esféricas discretas. La barra de escala representa 2 mm. 7. Las espumas y microportadores a continuación pueden rehidratarse gradualmente y se sembraron con células. Imágenes representativas se muestran de ASCs humanos (células viables = verde) sembradas en una espuma de DAT (izquierda) y microvehículo DAT (derecha). Las barras de escala representan 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Procesamiento de tejido Descelularizado Descelularización y liofilización tejido Decellularize (s) de interés siguiendo un protocolo establecido. NOTA: Los andamios en el estudio actual se han preparado siguiendo los protocolos publicados para descelularización DAT humano 28, DDT porcino 8, y porcino DLV 32. Comercialmente disponible, colágeno insoluble también puede utilizarse para fabricar espumas y microportadores, tales como colágeno procedente de tendón bovino, que ha sido utilizado con éxito durante un intervalo de concentración de 10 – 50 mg / mL. Otras fuentes de colágeno insolubles pueden ser utilizados, pero pueden requerir optimización para identificar el intervalo de concentración que producirá andamios estables. Transferir el tejido descelularizado hidratado o colágeno purificado en un tubo de centrífuga de 50 ml con fórceps y añadir suficiente agua doblemente destilada (ddH2O) para sumergir el tejido, tOA volumen total máximo de 35 mL. Congelación de la muestra durante la noche a -80 ° C, con el tubo de centrífuga en posición horizontal durante la congelación para maximizar el área de superficie para la sublimación durante la liofilización subsiguiente. Quitar el tapón del tubo de centrífuga y transferir la muestra congelada en un frasco de liofilización. Liofilizar la muestra utilizando un liofilizador de laboratorio durante 48 – 72 h o hasta que esté completamente seca. NOTA: El tiempo de secado puede variar para diferentes liofilizadores y tejidos descelularizado. Finamente picar el ECM liofilizado en trozos pequeños (~ 1 – 2 mm 3) utilizando tijeras quirúrgicas afiladas. Almacenar el ECM picada en un desecador hasta que esté listo para su posterior procesamiento. NOTA: Se recomienda que el ECM picada ser utilizado inmediatamente para evitar la absorción de humedad desde el medio ambiente. Cryomilling (opcional para la fabricación de espuma) Llenar una cámara de molienda de acero inoxidable de 25 ml para un Laboratosistema ry de molino de bola con ECM liofilizado picada y añadir dos bolas de molienda de acero inoxidable de 10 mm. Cierre y sumergir completamente la cámara de molienda cargado en nitrógeno líquido durante 3 min. Molino de la muestra congelada durante 3 min a 30 Hz (1800 rpm). Repita los pasos 1.2.2 y 1.2.3 hasta que el ECM se muele en un polvo fino. NOTA: El número de veces que estos pasos deben repetirse puede variar entre las fuentes de ECM. Por ejemplo, DAT normalmente requiere 3 ciclos de fresado para generar un polvo fino. Transferir el polvo utilizando un scoopula en un vial de vidrio, cerrar herméticamente, y almacenar en un desecador. Preparación ECM Suspensión Pesar 250 mg de cualquiera de picado (para espumas) o cryomilled (para espumas o microportadores) ECM y transferirlo a un tubo de centrífuga de 15 ml. Consulte el paso 1.1.6 y la sección 1.2 para la preparación de ECM picada y ECM cryomilled, respectivamente. NOTA: Este protocolo está diseñado para preparar una 50 mg / ml ECM suspensión, que se recomienda para DAT humana, porcina DDT y porcino DLV. Dependiendo de la fuente ECM específico, suspensiones uniformes pueden ser generados a concentraciones de partida más altas o más bajas. Añadir 5 ml de 0,22 M NaH 2 PO 4 (pH 5,4) tampón para el tubo de centrífuga y marcar el nivel de líquido en el tubo. Preparar una solución madre de α-amilasa mediante la adición de 7,5 mg de α-amilasa a 1 (5,4 pH) ml de tampón 0,22 M NaH 2 PO 4. Añadir 100 ml de la solución madre α-amilasa (0,75 mg de α-amilasa; 0,3% w / w de tejido seco) a la muestra. Añadir 0,22 M NaH 2 PO 4 para obtener un volumen final de 10 mL. Agitar la suspensión de forma continua a 300 rpm durante 72 h a temperatura ambiente. Centrifugar la suspensión a 1.500 xg durante 10 min. Recoger cuidadosamente y descartar el sobrenadante sin alterar el sedimento ECM digerido. Resuspender el material sedimentado en 10 ml de NaCl al 5% diluido en ddH 2 O. Repita el paso 1.3.5 para un total de dos enjuagues con 5% de NaCl en ddH 2 O. Eliminar el sobrenadante y resuspender el material sedimentado en 10 ml de ddH 2 O. Agitar la suspensión continuamente a 300 rpm durante 10 min a TA. Centrifugar la suspensión a 1.500 xg durante 10 min. Recoger cuidadosamente y descartar el sobrenadante sin alterar el sedimento ECM digerido. Añadir ácido acético 0,2 M hasta la marca de 5 ml hecha en el paso 1.3.2. Agitar la suspensión de forma continua a 120 rpm O / N a 37 ° C. Homogeneizar la suspensión ECM a temperatura ambiente en intervalos de diez segundos usando un homogeneizador de mano equipada con un diente de sierra 10 mm sonda amplia hasta que no hay fragmentos visibles permanecen. Coloque la suspensión en un vaso de precipitados de agua fría entre los intervalos de homogeneización para evitar el sobrecalentamiento. NOTA: Dependiendo de la fuente ECM, dilución adicional en ácido acético 0,2 M puede ser necesaria para obtener una suspensión homogénea. mienfriamiento xcessive de la suspensión ECM puede resultar en un aumento de viscosidad que puede interferir con homogeneización eficaz. Si se observa un aumento de viscosidad, la muestra puede ser recalentado a 37 ° C y se somete a un procesamiento adicional. Almacenar a 4 ° C durante hasta un mes antes de la espuma o fabricación microvehículo. 2. ECM-derivado Fabrication Foam Incubar la suspensión ECM desde el paso 1.3.13 (picado o cryomilled) a 37 ° C con agitación continua a 120 rpm hasta que la suspensión está caliente. Diluir la suspensión ECM en 0,2 M acético ácido a la concentración deseada. NOTA: Dependiendo de la fuente ECM, espumas estables se puede preparar en el rango de los 10 – 100 mg / ml, con un 15 – 50 mg / ml como el rango recomendado para DAT, DDT y DLV. Típicamente, las espumas fabricadas a concentraciones más altas serán ligeramente menos porosa pero más estable en cultivo y más fácil de manejar. Usando una jeringa de 3 ml wITH una aguja de 18 G para evitar la formación de burbujas en la suspensión ECM, llenar el molde deseado con la suspensión de ECM. Para fabricar la DAT, DDT, y espumas DLV, dispensar 400! L de 35 mg / suspensión ECM ml en una placa de cultivo tratados con células de 48 pocillos. NOTA: La forma del molde seleccionado y el volumen de suspensión ECM determinarán la geometría de la espuma resultante. Cubrir y congelar los moldes durante la noche, colocándolos en un -20 ° C o -80 ° C congelador. NOTA: La temperatura de congelación puede afectar a la porosidad de las espumas. Se espera que los poros más grandes cuando las muestras se congelan a -20 ° C en comparación con -80 ° C debido a la formación de cristales de hielo más grandes 33. Para fabricar espumas con una estructura porosa uniforme, asegurar que el molde no está en contacto con una superficie conductora para evitar el enfriamiento direccional. Coloque los moldes que contienen las muestras congeladas en un matraz liofilizador. Conectar el matraz al liofilizador laboratsistema liofilizador ory y seco durante 24 h. NOTA: Es importante que la muestra permanece congelado antes de la liofilización. Almacenar las espumas liofilizadas en un desecador hasta que se requiera. 3. Fabricación microvehículo ECM-derivado a través de electrospraying NOTA: Una visión general de la electrospraying establecido se muestra en la Figura 2. Incubar la suspensión ECM cryomilled desde el paso 1.3.13 a 37 ° C con agitación continua a 100 rpm O / N. NOTA: Cryomilled ECM se utiliza para fabricar los microportadores ECM derivado de garantizar una mayor uniformidad en la suspensión y evitar la obstrucción durante electrospraying. Cargar 3 ml de suspensión de ECM en una jeringa de bloqueo 3 mL Luer y adjuntar una infusión con alas establecido en el ánima de la jeringa. NOTA: Una gama de calibres de aguja se puede utilizar, reconociendo que la selección puede influir en el tamaño y forma de los microvehículos resultantes. para fabricate los microportadores DAT, DDT, y DLV, utilizar una aguja 25 G. Fije la jeringa dentro de la bomba de jeringa. Fijar la aguja a un soporte vertical y la posición de la punta de la aguja verticalmente a una distancia de 4 – 6 cm desde la parte superior de un matraz Dewar bajo forma (250 – Gama 500 ml tamaño recomendado). Adjuntar un electrodo pinza de cocodrilo a la punta de la aguja y conectarlo a la terminal positiva de la fuente de alimentación de alta tensión. Doblar una tira de papel de aluminio (12 x 5 cm) sobre el borde del matraz vacío. Adjuntar un segundo electrodo de pinza de cocodrilo hasta el borde exterior de la lámina y conectarlo al terminal de tierra de la fuente de la fuente de alimentación. Llenar el matraz Dewar con nitrógeno líquido a aproximadamente 1 cm de la parte superior, de modo que ¾ de se sumerge la lámina. NOTA: Es importante mantener el matraz Dewar llena con nitrógeno líquido. La superficie del nitrógeno líquido debe ser inferior a 2 cm de la parte superior del matraz durante los proces electrosprayings. se requiere rellenado continuo del nitrógeno líquido para mantener un nivel constante durante electrospraying. Establecer la bomba de jeringa a una velocidad de infusión de 30 ml / h. NOTA: La variación de la velocidad de infusión se puede alterar la forma de microportadores y el diámetro, pero el rango recomendado es de 25 – 35 ml / h. Si bien depende de la viscosidad de la suspensión altamente, velocidades de flujo por debajo de 25 ml / h puede resultar en la generación de microportadores más grandes. A caudales muy bajos, el tamaño y la forma de los microvehículos pueden llegar a ser menos homogénea. A velocidades de infusión por encima de 35 ml / h, la uniformidad de las gotitas generadas a través de electrospraying puede ser interrumpido, resultando en microportadores no esféricas con una distribución de tamaños más amplia 34. Aplicar un voltaje de 20 kV y encienda la bomba de jeringa para iniciar electrospraying. NOTA: El voltaje se puede variar para ajustar el tamaño de los microvehículos y tiende a tener un mayor impacto en el diámetro que el Infusiotasa n. El rango de tensión recomendada es de 15 – 25 kV. Una disminución en el diámetro de microportadores se espera que con un aumento de la tensión de 35. Una vez que la infusión se ha completado, con cuidado vierta el exceso de nitrógeno líquido desde el Dewar, dejando a los microvehículos en suspensión en ~ 25 ml de nitrógeno líquido para asegurar que se mantienen congelados. Transferir inmediatamente los microportadores con el nitrógeno líquido en un tubo de centrífuga de 50 ml mediante el vertido en un movimiento suave. Recoger cualquier microvehículos congelados que quedan en el Dewar con una scoopula y añadirlos al tubo de centrífuga. NOTA: Dependiendo del tamaño de la Dewar, los microportadores en nitrógeno líquido puede ser vertido inicialmente en un recipiente de tamaño medio, y después se transfirió inmediatamente en el tubo de centrífuga de 50 ml. Cubrir el tubo de centrífuga que contiene los microportadores en nitrógeno líquido con papel de aluminio perforada con pequeños agujeros en la preparación para la liofilización. Coloque la centrífuga cubiertotubos en un matraz liofilizador. conectar inmediatamente el matraz al liofilizador y secar las muestras de O / N. NOTA: Es muy importante mantener los microvehículos en suspensión en nitrógeno líquido para asegurar que no se descongelan antes de este paso, como descongelación puede resultar en el colapso y / o agregación. DAT, DDT y DLV microportadores fabricados a una concentración de 35 mg / ml usando las condiciones electrospraying descritos anteriormente tendrán típicamente un diámetro hidratado que oscila entre 350 – 500! M de tamaño. La distribución del tamaño puede variar dependiendo de la fuente ECM. Almacenar los microvehículos liofilizados en un desecador hasta que se requiera. Figura 2. Visión general del Aparato electrospraying utilizado en microvehículo Fabrication. A: Imagen que muestra la disposición de los equipos clave electrospraying incluyendo la bomba de jeringay fuente de alimentación de alta tensión, así como el posicionamiento de la aguja en relación con el Dewar de nitrógeno líquido. B: electrospraying esquemática, incluyendo los rangos recomendados para la tensión, velocidad de infusión, y la distancia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Espumas de preparación y microportadores para el cultivo celular rehidratación Transferencia de las espumas liofilizadas con fórceps en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene el exceso de etanol absoluto (~ 99,9%) (~ 5: 1 de etanol para espumas). Del mismo modo, resuspender los microportadores liofilizado en exceso de etanol absoluto dentro del tubo de centrífuga original usado para la colección. Utilizando una pipeta serológica, filtrar los microvehículos a través de un tamiz de acero con un tamaño de malla definida en un nuevo tubo de centrífuga de 50 ml para eliminar cualquier agregado y seleccionar para rangos de tamaño deseados. NOTA: Si las espumas se fabrican dentro de placas TCPS, pueden ser rehidratados directamente dentro de estos vasos. Incubar a 4 ° C durante 4 h o hasta que las espumas o microportadores tienen gravedad asentado en el fondo del tubo de centrífuga. Realizar todos los pasos subsiguientes en una campana de flujo laminar utilizando reactivos estériles y una técnica aséptica apropiada. Retire el etanol absoluto usando una pipeta serológica y añadir exceso (proporción 5: 1) 95% de etanol diluido con solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a los andamios. Incubar a 4 ° C durante 4 h o hasta que los andamios de ECM derivados han hundido hasta el fondo del recipiente de rehidratación. Poco a poco rehidratar los armazones a través de una serie de etanol (90, 85, 80, 75, 70, 50, 25 y 0%, se diluyó con PBS estéril). En cada paso, se incuba a 4 ° C hasta que los andamios han hundido hasta el fondo del recipiente antes de cambiar la solución. Desgasificar la andamios bajo vacío luz si la formación de burbujas dentro de los andamios es observed. Sustituir el PBS estéril durante dos aclarados adicionales para eliminar el etanol residual. Tienda en el 100% PBS estéril a 4 ° C hasta que esté listo para el cultivo celular. Utilizar los andamios dentro de 1 – 2 semanas después de la rehidratación. Preparación para la siembra de células En el día antes de la siembra, la transferencia de las espumas utilizando fórceps en cultivo celular tratado bien placas o insertos transwell y añadir suficiente medio de cultivo celular (seleccionado basado en el tipo celular de interés) para sumergir completamente los andamios (por ejemplo, 2,5 ml / andamio en una placa de 12 pocillos). Del mismo modo, permiten que los microportadores a la gravedad se asientan dentro del tubo de centrífuga, cuidadosamente quitar el PBS usando una pipeta serológica sin molestar a los microvehículos, y añadir medio de cultivo celular para lograr una relación 5: 1 de medio de a los microvehículos. NOTA: para la siembra ASCs humanos, utilizar un medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM): Mezcla de nutrientes F12 de Ham suplementado con10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Sustituir el medio de cultivo celular para un total de un aclarado. Equilibrar la noche a la mañana andamios en medio de cultivo celular a 37 ° C. Los andamios estarán listas para la siembra de células al día siguiente. NOTA: Las espumas se puede sembrar estáticamente en insertos de cultivo celular o placas de pocillos de cultivo de tejido 29, o dinámicamente sembró usando un agitador de laboratorio 36. Dependiendo de la fuente ECM, los métodos de procesamiento y concentración de la suspensión, la siembra dinámica puede mejorar la unión celular inicial, la proliferación y la infiltración. Los microvehículos pueden sembrarse dinámicamente usando un sistema de cultivo spinner 11.

Representative Results

En el estudio actual, hemos fabricado espumas y microportadores ECM derivado usando DAT humano, DDT porcino, y porcino DLV como ejemplos representativos que demuestran que las técnicas se pueden aplicar para generar matrices biodegradables específicos de tejido utilizando una variedad de tejidos descelularizados como fuentes de ECM ( la Figura 1). Por tanto la espuma y microvehículo fabricación, la técnica Nishihara de solubilización de colágeno con la enzima glucolítica α-amilasa 37 se adapta para generar una suspensión ECM viscoso a partir de los materiales de tejido de partida descelularizado, que se utiliza para sintetizar las matrices biodegradables a través de procedimientos de congelación y liofilización controladas. Para fabricar las espumas, los tejidos descelularizados pueden ser procesados ​​a través de cualquiera de picar carne mecánica o cryomilling para aumentar el área de la superficie antes de la digestión enzimática. Siguiendo45; amilasa tratamiento y la homogeneización, la suspensión ECM resultante se dispensa en un molde definida por el usuario, que luego se congeló y se liofilizó. Los andamios se pueden almacenar de forma estable en un estado seco durante un período prolongado de tiempo. Antes del uso en estudios de cultivo celular, los andamios liofilizados deben ser sometidos a un proceso de rehidratación controlada que produce espumas homogéneas porosas y altamente hidratadas derivados de ECM puro (Figura 3A). Si las espumas se rehidratan demasiado rápido, hinchazón rápida puede dañar características estructurales delicados, lo que resulta en la pérdida de la integridad y el colapso estructural. En general, las espumas se conservan la forma definida por el molde original después de la rehidratación y son estables sin necesidad de reticulación química. Figura 3B muestra de microscopio electrónico de barrido representante imágenes (SEM) de la DAT, DDT, y DLV espumas fabricado con ECM cryomilled a una concentración de 35 mg / ml y una temperatura de congelación de -80 & #176; C. Figura 3. Imágenes representativas de la DAT, DDT, y DLV Espumas Fabricado con Cryomilled ECM suspensiones a una concentración de 35 mg / ml y se congeló a -80 ° C. A: vista macroscópica de la DAT, DDT, y DLV muele espumas sintetizados en un molde de placa de cultivo tisular de 48 pocillos después de la rehidratación. Las barras de escala representan 1 cm. B: imágenes de SEM de las espumas DAT, DDT, y DLV que muestran una ultraestructura porosa homogénea. Las barras de escala representan 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Las suspensiones de ECM cryomilled también se pueden utilizar para generar microportadores ECM derivados puros mediante técnicas electrospraying (Figura 2 </strong>). Para cada fuente de ECM, la concentración de la suspensión, calibre de la aguja, la velocidad de infusión, y el voltaje puede ser sintonizado para generar microportadores esféricas discretas que van desde 350 hasta 500 micras de diámetro siguiente rehidratación controlada (Figura 4A). Mientras que los microportadores se pueden almacenar en un estado liofilizado, se recomienda para la facilidad de manipulación que se dispensan o se tamizaron a un intervalo de tamaño deseado después de la resuspensión en etanol. Formación de imágenes SEM sugiere que la ultraestructura microvehículo puede variar dependiendo de la fuente de tejido descelularizado (Figura 4B). Figura 4. Imágenes representativas de la DAT, DDT, y DLV microportadores Fabricado con Cryomilled ECM suspensiones a una concentración de 35 mg / ml, una velocidad de infusión de 0,5 ml / min, y una tensión aplicada de 20 kV. A: Aspecto macroscópico of los hidratadas microportadores DAT, DDT, y DLV. Las barras de escala representan 4 mm. B: imágenes de SEM de los microvehículos DAT, DDT, y DLV que muestran que la ultrasonografía y el tamaño pueden variar dependiendo de la fuente de ECM. Las barras de escala representan 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Las propiedades mecánicas de los andamios son dependientes de la fuente de ECM, el método de procesamiento aplicado (es decir, el picado frente cryomilling), la concentración de la suspensión ECM, y la temperatura de congelación. En general, los armazones son suaves y compatibles, con módulos de Young en el intervalo de de 1 – 5 kPa reportados para el DAT (50 y 100 mg / ml) 29 y espumas DLV (20 – 50 mg / ml) 31, y <1 kpa para los microportadores. las espumas cryomilled son típicamente más suave ºuna de picado debido a su naturaleza perturbado. se necesitan sistemas ensayos mecánicos especializados equipados con células carga altamente sensibles la caracterización precisa propiedades compresión. típicamente, y microportadores tendrían módulos bajos que tejidos descelularizados nativas etapas procesamiento adicionales implicados en fabricación incluyendo digestión enzimática homogeneización, así como no covalentemente reticulado andamios. sin embargo, esto puede variar dependiendo del tejido interés. por ejemplo, trabajos anteriores, encontró picada dat fabricadas altas concentraciones ecm (100 mg >

Discussion

En general, matrices biodegradables derivadas de tejidos descelularizados pueden aproximarse más de cerca la composición 3D compleja y estructura de la ECM en el microambiente celular nativo en comparación con andamios sintéticos o modelos de cultivo estándar basados ​​en 2D TCPS. Como se discutió previamente, las interacciones célula-ECM son críticamente importantes en la mediación de comportamiento celular tanto en cultivo como en el cuerpo ^1. Reconociendo que las propiedades bioquímicas, biofísicas y biomecánicas de la ECM son únicos para cada tejido, cada vez hay más evidencia para apoyar la justificación de la aplicación de enfoques específicos de tejido en el diseño de biomateriales para ingeniería de tejidos, así como en el desarrollo de más fisiológicamente modelos de cultivo relevantes para los experimentos in vitro ^20. La utilización de tejidos descelularizados como material de partida, nuestros métodos pueden incorporar la compleja composición de la ECM específico de tejido dentro de más custformatos de andamio omizable. Mientras que los pasos mecánicos y enzimáticos de procesamiento se traducirá en una pérdida de la ultraestructura ECM nativa, estudios previos con DAT han demostrado que los efectos instructivos de la MEC derivadas de tejido adiposo se conservan en estos formatos de andamio, lo que sugiere que la composición bioscaffold es un mediador clave de la función celular ^{11, 29.} Una ventaja importante del uso de las espumas y microportadores ECM derivados como sustratos de cultivo celular en comparación con los tejidos descelularizados intactos es que son más homogénea, lo que puede mejorar la uniformidad en la distribución de células y de las interacciones célula-célula / célula-ECM.

Los métodos descritos aquí pueden ser utilizados para generar una amplia gama de matrices biodegradables específicos de tejido para su uso en el cultivo celular y aplicaciones de ingeniería de tejidos. Por ejemplo, además de la DAT, DDT, y DLV, nuestro laboratorio ha aplicado con éxito estas técnicas para generar por 3Despumas OU utilizando hueso descelularizado, cartílago, el núcleo pulposo, y anillo fibroso, así como comercialmente disponible colágeno, insoluble derivado de tendón bovino. Desde una perspectiva in vitro, estas matrices biodegradables podrían ser utilizados como una base para modelos de mayor fidelidad 3D de cultivo para la investigación de la biología celular, la fisiología o patología de la enfermedad ^38, como sustratos bioactivos en alto rendimiento plataformas de cribado de fármacos ^39, o matrices como instructivo para vástago diferenciación ^{40, 41} de células. DAT, DDT y DLV espumas fabricadas a concentraciones de 25 – 50 mg / ml son estables a largo plazo pt cultivo in vitro (probado hasta 28 días). Además, los tres tipos de microportadores pueden apoyar la unión de células y la proliferación bajo condiciones dinámicas en un sistema de cultivo spinner de bajo cizallamiento (10 – 15 rpm) durante al menos 2 semanas. Para aplicaciones in vivo, el biocompatible y biodegradaespumas y microportadores ble ECM derivados son prometedores como productos off-the-shelf para estimular la remodelación de tejidos constructiva y regeneración ^{11, 29.} Además, los andamios de células adhesivo podrían utilizarse como sistemas de administración de la terapia de células ^{42, 43.} Como ejemplo, se muestran espumas DAT para promover la angiogénesis y la adipogénesis cuando se sembró con ASCs alogénicas y se implantaron por vía subcutánea en un modelo de rata inmunocompetente ^29. En relación con el DAT intacto, el DAT más altamente procesados ​​espumas degrada mucho más rápidamente, con una reducción del 50% en el volumen observó a las 3 semanas, ya que se integraron con los tejidos del huésped, y casi completa resorción por 12 semanas. Sin embargo, las espumas también indujeron una respuesta angiogénica más potente, lo que sugiere que el ECM enzima digerido tuvo efectos pro-regenerativas únicas. Del mismo modo, los microportadores ECM derivados podrían ser utilizados como in vitro </ em> sustratos de cultivo de células dentro de los sistemas de cultivo dinámicos y vehículos de suministro de células como inyectables ^{11, 30, 44.} Más específicamente, la zona de pequeño diámetro y gran superficie de los microportadores podría permitir la entrega de una gran cantidad de células en un pequeño volumen, mientras que proporciona una matriz que puede ayudar a apoyar la viabilidad celular y aumentar la retención de células en el sitio de inyección ^30. Antes del uso en cualquier sistema vivo, es crítico para asegurar que el ECM fuente es sustancialmente desprovista de componentes celulares antigénicos y / o reactivos descelularización potencialmente citotóxicos que podrían desencadenar una respuesta del huésped negativo ^7.

La enzima pepsina proteolítica se utiliza comúnmente en la preparación de hidrogeles de ECM derivado ^15. La pepsina es una proteasa no específica que digerir las proteínas de colágeno y otra ECM into fragmentos pequeños ^45. Mientras que los hidrogeles fabricados a partir de ECM pepsina-digerido se han notificado a tener efectos de células instructivo, una limitación es que estos materiales tienden a ser extremadamente mecánicamente débil ^46. En nuestro desarrollo inicial de los microportadores DAT, se utilizó un enfoque compuesto en el que la pepsina-digerido DAT se combinó con alginato y se añadió gota a gota en CaCl ₂ para formar perlas esféricas ^30. Las perlas se posteriormente foto-reticulado y el alginato se extrajo usando citrato de sodio. Además del requisito para la reticulación química, una limitación clave fue que los microportadores fabricados con este enfoque tenían una pobre estabilidad por debajo de un intervalo de tamaños de 900 a 950 micras ^30. En lugar de pepsina, los métodos presentados aquí utilizan una digestión más leve de la ECM con la enzima glucolítica α-amilasa, que se postula para escindir los grupos de hidratos de carbono de la teloperegiones ptide de colágeno, lo que aumenta la solubilidad en ácido acético ^37. Este enfoque permite el aislamiento de colágeno altamente polimerizada que puede ser utilizado para generar espumas y microportadores puros ECM derivados sin la necesidad de reticulación química o otros aditivos. Estas matrices biodegradables se estabilizan a través de interacciones físicas y enlaces de hidrógeno entre las fibrillas de colágeno bien conservados, similar al colágeno en el microambiente ECM nativa.

Las espumas son una plataforma altamente flexible que puede ser fabricado en una amplia gama de geometrías en función del molde específico seleccionado. Para los estudios de cultivo de células, las espumas pueden ser emitidos directamente en placas de pocillos TCPS, para formar recubrimientos o andamios 3D de espesor variable. Para fabricar espumas 3D con superficies muy uniformes, se recomienda que un molde personalizado está diseñado que pueda ser sellado por ambos lados con plástico o vidrio diapositivas. De cualquier ECM picado o cryomilled puede ser usada para sintetizarlas espumas. En general, hemos encontrado que las espumas cryomilled tienden a ser macroscópicamente más suave y tienen una ultraestructura más interrumpido a concentraciones inferiores ^{31, 36.} Dependiendo de la fuente de tejido, los pasos adicionales de procesamiento mecánicos pueden causar alteraciones en la composición de la MEC que podría afectar la función celular. Por ejemplo, en nuestro trabajo anterior, se detectó la laminina en espumas DLV picados, pero no cryomilled DLV espuma ^31. En contraste, el colágeno I, colágeno IV, laminina y fibronectina se detectaron en ambos picada y cryomilled DAT espuma ^36. Además de las etapas de tratamiento mecánicas, el tamaño de la porosidad y de poros de las espumas se puede ajustar en cierta medida por la variación de la concentración de la suspensión ECM y la temperatura de congelación ^47. En general, las espumas de concentración más bajos (~ 10 – 15 mg / ml) son cualitativamente más porosa, pero pueden contraerse rápidamente y tienen pobreestabilidad en cultivo a largo plazo ^{31, 36.} Del mismo modo, una velocidad de congelación más lenta, típicamente conseguido por una temperatura de congelación más alto, puede resultar en poros más grandes en las espumas debido al tamaño de los cristales de hielo formados durante la fabricación ^29. Todos estos parámetros pueden influir en las interacciones celulares con los materiales, incluyendo el apego, infiltración, y remodelación. Por ejemplo, el crecimiento celular en las espumas que se fabrican con concentraciones más altas de ECM puede estar limitada a las zonas de la superficie, en particular con las fuentes de ECM picados y bajo condiciones de cultivo estáticas ^36.

Para los microportadores, los parámetros clave que pueden ser sintonizados son la concentración de la suspensión ECM, calibre de la aguja, y la tensión aplicada, con concentraciones más altas típicamente produciendo microportadores que son más estables en cultivo dinámico a largo plazo. Tras el inicio de electrospraying, los suspens ECMgotitas de iones deben caer rápidamente en el centro del matraz, hacia la dirección del colector de papel de aluminio. Para evitar la agregación, es importante que las perlas en contacto con el nitrógeno líquido antes de la lámina. La distancia entre la aguja y la superficie del nitrógeno líquido puede ajustarse para cumplir estos requisitos. Es importante tener en cuenta que la optimización puede ser necesaria dependiendo de las propiedades de cada fuente ECM específico, en particular en la selección del intervalo de concentraciones que va a generar matrices biodegradables estables. Otro factor clave es el protocolo de descelularización que se utiliza para generar los materiales de partida, como los métodos de descelularización que degradan el ECM o la presencia de reactivos residuales (por ejemplo, tensioactivos) puede influir negativamente en la estabilidad de las espumas y microportadores resultantes. Si desafíos se encuentran con la estabilidad bioscaffold, opciones que pueden ser investigados incluyen el uso de un proceso de rehidratación más gradual, aumentando la susp ECMconcentración ensión, y la exploración de picada frente ECM cryomilled. En caso de que todas estas opciones no resolver el problema, puede ser necesario explorar los protocolos de descelularización o fuentes alternativas de ECM.

Para asegurar la reproducibilidad durante la producción de andamios, la atención especial debe ser tomada en ciertos pasos en el protocolo. Cuando cryomilling los tejidos descelularizados, se recomienda que la molienda se llevó a cabo inmediatamente después de la liofilización en un entorno seco para reducir la probabilidad de la agregación de partículas debido a la absorción de la humedad del medio ambiente. Durante la fabricación de microportadores, se sugiere que la suspensión se electro pulverizada en pequeños lotes, con un volumen máximo de 3 ml, para evitar problemas con el enfriamiento de la muestra que pueden resultar en obstrucción de la aguja. Además, es esencial que los microvehículos no se les permite descongelar después del proceso de electrospraying. Para mantener su geometría esférica y la estabilidad mecánica, el microcarriERS se recogen en el nitrógeno líquido, que se transportan en un contenedor lleno de nitrógeno líquido, e inmediatamente se liofilizó. Por último, tanto para las espumas y microportadores, es crítico que los pasos de rehidratación se realizan lentamente durante un período de varios días. rehidratación rápida puede resultar en el colapso estructural en el macro- y / o micro-escala. Además, la rehidratación tiene que ocurrir lentamente para evitar la formación de pequeñas burbujas de aire dentro del andamio, que pueden requerir una cantidad significativa de tiempo para desgasificar a vacío la luz.

En conclusión, los métodos presentados en este documento se pueden usar para fabricar una amplia gama de espumas específicos de tejido y microportadores compuestos de ECM puro, no reticulado químicamente. Una ventaja para los investigadores biológicos es que las matrices biodegradables son fáciles de manejar y se pueden procesar de manera similar a los tejidos al realizar los análisis con técnicas tales como ensayos de histología, inmunohistoquímica, o de genes y expresión de proteínas.Además, los andamios de ECM derivados pueden ser enzimáticamente degradada para extraer las poblaciones de células sembradas o se puede utilizar directamente como vehículos de administración de células biodegradables y biocompatibles. En general, esta tecnología plataforma flexible tiene gran utilidad para numerosas aplicaciones, incluyendo para los estudios de cultivo de células en 3D que investigan la función celular, como sustratos de expansión celular y matrices biodegradables como pro-regenerativas.

Materials

Acetic acid, glacial	BioShop	ACE222.500
Alligator clip leads	VWR	470149-728
Aluminium foil	Fisher Scientific	01-213-101
a-amylase	Sigma	101074694	from Aspergillus aryzae
Analytical balance	Sartorius	CPA225D
Centrifuge	Thermo Scientific	75004251	With swinging bucket rotor for 15 and 50 mL centrifuge tubes
Centrifuge tubes (15 mL)	Sarstedt	62.554.205
Centrifuge tubes (50 mL)	Sarstedt	62.547.205
Collagen from bovine achilles tendon (insoluble)	Sigma	C9879	Or similar insoluble collagen source; Can be used as an alternative to decellularized tissues to fabricate the foams and microcarriers
Cryomilling system	Retsch	20.745.0001	MM 400
Dessicator	Fisher Scientific	8624426	For lyophilized ECM and bioscaffold storage
DMEM: F12 Hams	Sigma	D6421	Used for proliferation media
Dewar flask	Fisher Scientific	10-196-6	Low form; volume range of 250 – 500 mL
Double distilled water			From Barnstead GenPure xCAD Water Purification System
D-PBS	Wisent	311425125
ECM			Isolated from human adipose tissue, porcine dermis or porcine myocardium, as described in Flynn et al. 2010, Reing et al. 2010, and Wainwright et al. 2010 (ref # 28, 8, 32)
Ethanol	Greenfield Specialty Alcohols Inc.	P016EAAN	Absolute
Fetal bovine serum	Wisent	80150	Used for proliferation media
Forceps	VWR	37-501-32	For transferring the foams
Freezer (-20 °C)	VWR	97043-346
Freezer ( -80 °C)	Thermo Scientific	EXF40086A
Glass vials	Fisher Scientific	03-339-26D	To store lyophilized cryomilled ECM
Hand held homogenizer	Fisher Scientific	14-359-251	Speed: 8000 – 30,000 RPM
Homogenizer accessories: saw tooth bottom generator probes	Fisher Scientific	14-261-17	10 X 95 mm
Liquid nitrogen			For electrospraying
Lyophilizer	Labconco	7750021	FreeZone4.5
Milling chamber	Retsch	02.462.0213	25 mL volume recommended
Milling balls	VWR	16003-606	10 mm diameter, stainless steel recommended
18G needle	VWR	C ABD305185	For dispensing ECM suspension into moulds
Orbital incubator shaker	SciLogex	832010089999	Temperature controlled (37 °C)
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140-122	Used for proliferation media
Pipet-Aid XP	Mandel Scientific	DRU-4-000-101
Retort stand	VWR	470019-526
Retort stand clamp	VWR	21573-606
Safety-Lok Syringe	BD	309606	3 mL luer lock syringe for microcarrier fabrication and dispensing ECM suspension
Serological pipettes (10 mL )	Sarstedt	86.1254.001
Serological pipettes (25 mL)	Sarstedt	86.1685.001
Sodium chloride	BioShop	7647-14-5
Sodium phosphate monobasic	BioShop	10049-21-5
Scoopula	VWR	89259-968	For collecting microcarriers
Surgical scissors	VWR	82027-590
Syringe pump	VWR	10117-490	Microprocessor controlled
High voltage power supply	Gamma High Voltage Research	ES30P-5W/DDPM	Capable of recommended 15 – 25 kV voltage range
12-well plates	Fisher Scientific	12565321	For use as molds during foam fabrication; Other sizes or user-defined molds can also be selected
Winged infusion set	Terumo	22258092	30 cm tubing length, 25 G 3/4 " recommended; Other needle gauges can be used and may influence microcarrier diameter