en<em> In vitro</em> Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps
Summary
Hel organkultur af diskusprolaps (IVD) bevarer det native ekstracellulære matrix, cellefænotyper, og cellulær-matrix-interaktioner. Her beskriver vi et IVD kultur-system ved hjælp af musen lumbal og caudale IVDs i deres funktionelle spinal enheder og flere programmer udnytter dette system.
Abstract
Diskusprolaps (IVD) degeneration er en væsentlig bidragyder til lændesmerter. IVD er en fibrocartilaginous fælles, der tjener til at transmittere og dæmpe belastninger i rygsøjlen. IVD består af en proteoglycan-rig nucleus pulposus (NP) og en kollagenrigt annulus fibrose (AF) klemt af bruskagtige endeplader. Sammen med de tilstødende ryghvirvler, ryghvirvler-IVD struktur danner en funktionel rygsøjle enhed (FSU). Disse mikrostrukturer indeholder unikke celletyper samt unikke ekstracellulære matrixer. Hel organkultur af FSU bevarer den native ekstracellulære matrix, celledifferentieringsfaktorer fænotyper, og cellulær-matrix-interaktioner. Således orgel dyrkningsteknikker er særligt nyttige til at undersøge de komplekse biologiske mekanismer IVD. Her beskriver vi en high-throughput tilgang til dyrkning hele lumbal mus FSU'er der giver en ideel platform til at studere sygdomsmekanismer og terapier til IVD. Desuden beskriver vi several programmer, der udnytter dette organ dyrkningsmetode at foretage yderligere undersøgelser, herunder kontrastforøget microCT billeddannelse og tredimensionale høj opløsning finite element modellering af IVD.
Introduction
Lændesmerter (LBP) er den vigtigste faktor for global handicap og tabt produktivitet på arbejdspladsen, og amerikanerne alene tilbringer på over 50 milliarder dollars på LBP behandling 1. Selvom udbredt, ætiologi LBP forbliver kompleks og multifaktoriel. Imidlertid diskusprolaps (IVD) degeneration er blandt de mest betydningsfulde risikofaktorer for LBP 2.
IVD er lavet af tre mikrostrukturer: den ydre annulus fibrose (AF), den indre nucleus pulposus (NP), og to bruskendeplader der omslutter hele strukturen proksimalt og distalt 3. Med aldring og degeneration, de IVD komponenter ændres strukturelt, sammensætningsmæssigt og mekanisk 4. Disse ændringer omfatter tab af proteoglycaner og hydratisering i NP, nedsat skive højde, og forværredes mekanisk kompetence 5. Disse ændringer erofte ledsaget af cytokiner, der fremmer et inflammatorisk respons, såvel som neutrofil og dorsalrodsganglion indtrængen i ledspalten kulminerede i en kaskade af begivenheder, der fører til LBP symptomer 6.
At studere mekanismerne i IVD degeneration er udfordrende i mennesker, fordi det ofte ikke er muligt at isolere årsagen til degeneration før forekomsten af lændesmerter. , Reduktionist villet forenkle eksperimentelle system ned til IVD organ muliggør således mekanistisk finjustering af årsagsvariablerne og undersøge deres downstream virkninger 5. Systemet reduceres til kun den native cellepopulation og omgivende ekstracellulære matrix, hvilket muliggør direkte fortolkning af virkningerne af eksterne stimuli på IVD degeneration. Desuden lavere omkostninger og skalerbarhed af murine modeller, samt det store antal genetisk modificerede dyr 7, tillader than hurtig målrettet screening af IVD degenerative mekanismer og potentielle behandlinger. Her beskriver vi et murint organkultursystem hvori IVD cellulære og vævsstabilitet opretholdes i 21 dage, med særlig fokus gives til IVDs' homeostatiske, mekaniske, strukturelle og inflammatoriske mønstre. Ved hjælp af denne metode, overvåger vi de IVDs funktionelle ændringer i et stik-induceret skade model 8 til at forstå mekanismerne bag disc degeneration. Desuden beskriver vi flere anvendelser af denne organkultur metode til at foretage yderligere undersøgelser, herunder kontrastforøget microCT billeddannelse og tredimensionale høj opløsning modellering af IVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en organkultur af den murine FSU med vægt på overvågning af de biologiske ændringer i IVD. Den vellykkede vedligeholdelse af disse kulturer kræver nøje sterile teknikker. Navnlig dissektion trin 2,1-2,6 og kulturen trin 3,1-3,6 kræver særlig omhu for at sikre sterile forhold opretholdes, og bør udføres disse trin fortrinsvis i en isoleret procedure værelse med et HEPA luftstrøm for at minimere kontaminanter. Fordi dissektion proces medfører traumer t…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Washington University Muskuloskeletal Forskningscenter (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Training Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, og NIH K01AR069116. Forfatterne vil gerne takke Patrick Wong for hans bidrag i dataindsamlingen.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Referências
- Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
- Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).
- Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).
- Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).
- Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).
- Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).
- Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).
- Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).
- Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
- Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
- Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116 (12), (2014).
