एक<em> इन विट्रो</em> अंग संस्कृति म्यूरीन intervertebral डिस्क के मॉडल
Summary
intervertebral डिस्क (IVD) के पूरे अंग संस्कृति देशी बाह्य मैट्रिक्स, सेल समलक्षणियों, और सेलुलर-मैट्रिक्स बातचीत बरकरार रखता है। यहाँ हम माउस काठ का और उनके कार्यात्मक रीढ़ की इकाइयों में दुम IVDs और कई आवेदनों इस प्रणाली का उपयोग का उपयोग कर एक IVD संस्कृति प्रणाली का वर्णन।
Abstract
Intervertebral डिस्क (IVD) अध: पतन कम पीठ दर्द में महत्वपूर्ण योगदान है। IVD एक fibrocartilaginous संयुक्त कि संचारित और रीढ़ की हड्डी में भार गीला करने के लिए कार्य करता है। IVD एक proteoglycan युक्त नाभिक pulposus (एनपी) और एक कोलेजन युक्त वलय फाइब्रोसिस (वायुसेना) उपास्थि अंत प्लेटों द्वारा sandwiched के होते हैं। साथ में आसन्न कशेरुकाओं के साथ, कशेरुकाओं-IVD संरचना एक कार्यात्मक रीढ़ इकाई (FSU) रूपों। ये microstructures अद्वितीय प्रकार की कोशिकाओं के साथ-साथ अद्वितीय कोशिकी मैट्रिक्स होते हैं। FSU के पूरे अंग संस्कृति देशी बाह्य मैट्रिक्स, सेल भेदभाव समलक्षणियों, और सेलुलर-मैट्रिक्स बातचीत बरकरार रखता है। इस प्रकार, अंग कल्चर तकनीक IVD के जटिल जैविक तंत्र की जांच के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। यहाँ, हम पूरे काठ का माउस FSUS कि IVD के लिए रोग तंत्र और चिकित्सा के अध्ययन के लिए एक आदर्श मंच प्रदान करता है संवर्धन के लिए एक उच्च throughput दृष्टिकोण का वर्णन। इसके अलावा, हम रों का वर्णनeveral अनुप्रयोगों है कि इसके विपरीत-बढ़ाया microCT इमेजिंग और IVD के तीन आयामी उच्च संकल्प परिमित तत्व मॉडलिंग सहित आगे के अध्ययन का संचालन करने के इस अंग संस्कृति पद्धति का उपयोग।
Introduction
कम पीठ दर्द (LBP) वैश्विक विकलांगता के लिए प्रमुख कारक और कार्यस्थल में उत्पादकता है, और अमेरिकियों अकेले LBP उपचार 1 पर 50 अरब डॉलर से अधिक खर्च करते हैं। हालांकि प्रचलित, LBP एटियलजि जटिल और बहुघटकीय बनी हुई है। हालांकि, intervertebral डिस्क (IVD) अध: पतन LBP 2 के लिए सबसे महत्वपूर्ण जोखिम वाले कारकों में से एक है।
IVD तीन microstructures से बना है: बाहरी वलय फाइब्रोसिस (वायुसेना), आंतरिक नाभिक pulposus (एनपी), और दो उपास्थि endplates कि पूरे संरचना proximally और distally 3 सैंडविच। उम्र बढ़ने और अध: पतन के साथ, IVD घटकों संरचनात्मक रूप से बदलने के लिए, संघटनात्मक, और यंत्रवत् 4। इन परिवर्तनों प्रोटियोग्लाइकन और एनपी में हाइड्रेशन की हानि शामिल हैं, डिस्क ऊंचाई में कमी आई, और यांत्रिक क्षमता 5 बिगड़ गया। ये परिवर्तन कर रहे हैंअक्सर साइटोकिन्स कि एक भड़काऊ प्रतिक्रिया है, साथ ही संयुक्त घटनाओं LBP लक्षण 6 के लिए नेतृत्व की एक झरना में समापन अंतरिक्ष में न्युट्रोफिल और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि घुसपैठ को बढ़ावा देने के साथ होगा।
IVD अध: पतन के तंत्र का अध्ययन मानव में चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह अक्सर कम पीठ दर्द की घटना से पहले अध: पतन का कारण अलग करना संभव नहीं है। इस प्रकार, IVD अंग के लिए नीचे प्रायोगिक प्रणाली को सरल बनाने का एक न्यूनकारी दृष्टिकोण कारण चर के यंत्रवत ठीक करने की अनुमति देता है और उनके नीचे की ओर प्रभाव 5 की जांच। प्रणाली केवल देशी सेल आबादी और बाह्य मैट्रिक्स आसपास करने के लिए कम है, इस प्रकार IVD अध: पतन पर बाहरी उत्तेजनाओं के प्रभाव का प्रत्यक्ष व्याख्या सक्षम करने से। इसके अलावा, कम लागत और murine मॉडल की क्षमता है, साथ ही आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों 7 की बड़ी संख्या, टी के लिए अनुमतिIVD अपक्षयी तंत्र और संभावित उपचारों के वह तेजी से लक्षित स्क्रीनिंग। यहाँ, हम जिसमें IVD सेलुलर और ऊतक स्थिरता IVDs ', समस्थिति यांत्रिक, संरचनात्मक, और भड़काऊ पैटर्न को दिया विशेष ध्यान देने के साथ, 21 दिनों में बनाए रखा है एक murine अंग संस्कृति प्रणाली का वर्णन। इस विधि का उपयोग करना, हम IVDs 'वार प्रेरित चोट 8 मॉडल में कार्यात्मक परिवर्तनों की निगरानी डिस्क अध: पतन के पीछे तंत्र को समझने के लिए। इसके अलावा, हम इस अंग संस्कृति विधि के कई अनुप्रयोगों विपरीत-बढ़ाया microCT इमेजिंग और IVD के तीन आयामी उच्च संकल्प मॉडलिंग सहित आगे के अध्ययन का संचालन करने का वर्णन।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल IVD में जैविक परिवर्तन की निगरानी पर जोर देने के साथ murine FSU का एक अंग संस्कृति की रूपरेखा। इन संस्कृतियों के सफल रखरखाव सावधान बाँझ तकनीक की आवश्यकता है। विशेष रूप से, विच्छेदन 2.1-2.6 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के वाशिंगटन विश्वविद्यालय पेशीकंकालीय रिसर्च सेंटर (एनआईएच P30 AR057235), आण्विक इमेजिंग सेंटर (एनआईएच P50 CA094056), mechanobiology प्रशिक्षण अनुदान (एनआईएच 5T32EB018266), एनआईएच R21AR069804, और एनआईएच K01AR069116 द्वारा समर्थित किया गया। लेखकों डेटा संग्रह में उनके योगदान के लिए पैट्रिक वोंग का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं।
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Referências
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