Un<em> In Vitro</em> Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine
Summary
cultura organo intero del disco intervertebrale (IVD) conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi cellulari, e le interazioni cellulari-matrice. Qui si descrive un sistema di coltura IVD usando lombare mouse e IVD caudale nei loro unità spinali funzionali e diverse applicazioni che utilizzano questo sistema.
Abstract
Disco intervertebrale (IVD) la degenerazione è un contributo significativo per il mal di schiena. L'IVD è una joint fibrocartilaginea che serve per trasmettere e smorzare i carichi nella colonna vertebrale. IVD consiste in un polposo ricco di proteoglicani nucleo (NP) e un ricco di collagene annulus fibrosi (AF) a sandwich da cartilaginee piastre terminali. Unitamente alle vertebre adiacenti, la struttura vertebre-IVD formano un'unità funzionale spina (FSU). Questi microstrutture contengono tipi di cellule uniche e matrici extracellulari unici. cultura organo intero FSU conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi differenziazione cellulare, e le interazioni cellulari-matrice. Pertanto, le tecniche di coltura organo sono particolarmente utili per studiare i complessi meccanismi biologici della IVD. Qui, descriviamo un approccio high-throughput per la coltura di tutta la FSU del mouse lombare che fornisce una piattaforma ideale per lo studio dei meccanismi di malattia e le terapie per l'IVD. Inoltre, descriviamo sapplicazioni everal che utilizzano questo metodo di coltura organo di condurre ulteriori studi tra cui l'imaging microCT mdc e tridimensionali ad alta risoluzione elementi finiti modellizzazione della IVD.
Introduction
Lombalgia (LBP) è il fattore principale per la disabilità globale e la perdita di produttività sul posto di lavoro, e gli americani spendono solo al di sopra di 50 miliardi di dollari sul trattamento LBP 1. Anche se prevalente, l'eziologia della LBP rimane complessa e multifattoriale. Tuttavia, disco intervertebrale (IVD) degenerazione è tra i fattori di rischio più significativi per LBP 2.
IVD è costituito da tre microstrutture: l'annulus fibrosi esterno (AF), l'interno del nucleo polposo (NP), e due placche cartilaginee che racchiudono l'intera struttura prossimale e distale 3. Con l'invecchiamento e la degenerazione, i componenti IVD cambiano strutturalmente, composizionale e meccanicamente 4. Queste modifiche comprendono la perdita di proteoglicani e idratazione del NP, diminuzione altezza del disco, ed è peggiorato competenza meccanica 5. Queste alterazioni sonospesso accompagnata da citochine che promuovono una risposta infiammatoria, così come neutrofili e radice dorsale ganglio intrusione nella cavità articolare culmina in una cascata di eventi che portano a sintomi LBP 6.
Studiando i meccanismi di degenerazione IVD è una sfida per l'uomo, perché spesso non è possibile per isolare la causa della degenerazione prima del verificarsi di lombalgia. Pertanto, un approccio riduttivo di semplificare il sistema sperimentale verso l'organo IVD consente meccanicistico messa a punto delle variabili causali ed esaminando i loro effetti a valle 5. Il sistema è ridotto a solo la popolazione di cellule nativa e circostante matrice extracellulare, permettendo così l'interpretazione diretta degli effetti degli stimoli esterni su IVD degenerazione. Inoltre, il basso costo e scalabilità di modelli murini, nonché il numero di animali geneticamente modificati 7, consentono tegli screening rapido mirato dei meccanismi degenerativi IVD e potenziali terapie. Qui, descriviamo un sistema di coltura organo murino in cui IVD cellulare e tissutale stabilità è mantenuta in 21 giorni, con particolare attenzione rivolta ai modelli omeostatici, meccaniche, strutturali e infiammatorie delle IVDs. Usando questo metodo, monitoriamo i cambiamenti funzionali IVDs' in un modello di lesione indotta stab-8 di comprendere i meccanismi alla base degenerazione del disco. Inoltre, descriviamo diverse applicazioni di questo metodo cultura organo condurre ulteriori studi tra cui l'imaging microCT mdc e tridimensionali ad alta risoluzione modellizzazione del IVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive una cultura organo del murino FSU con enfasi sul monitoraggio dei cambiamenti biologici nel IVD. La corretta gestione di queste colture richiede attente tecniche sterili. In particolare, la dissezione passi 2.1-2.6 e la cultura passi 3.1-3.6 richiedono particolare cura per assicurare condizioni di sterilità sono mantenuti, e questi passaggi deve essere eseguita preferibilmente in una stanza procedura isolato con un flusso d'aria HEPA per minimizzare contam…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Washington University muscoloscheletrico Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), mechanobiology Training Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, e NIH K01AR069116. Gli autori desiderano ringraziare Patrick Wong per il suo contributo nella raccolta dei dati.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Referências
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