en<em> In Vitro</em> Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive
Summary
Hele organkultur av mellomvirvelskiven (IVD) bevarer det native ekstracellulære matriks, celle fenotyper, og cellulær-matriks-vekselvirkninger. Her beskriver vi en IVD kultur system ved hjelp av musen korsryggen og caudal IVDs i deres funksjonelle spinal enheter og flere programmer som bruker dette systemet.
Abstract
Mellomvirvelskive (IVD) degenerasjon er en betydelig bidragsyter til ryggsmerter. IVD er en fibrocartilaginous ledd som tjener til å overføre og dempe belastninger i ryggraden. IVD består av et proteoglykan-rik nucleus pulposus (NP) og et kollagenrikt ringrommet fibrosis (AF) klemt av bruskendeplater. Sammen med de tilstøtende ryggvirvler, danner virvler-IVD struktur en funksjonell ryggrad enhet (FSU). Disse mikrostrukturene inneholder unike celletyper samt unike ekstracellulære matriser. Hele organkultur av FSU bevarer den opprinnelige ekstracellulære matriks, av celledifferensiering fenotyper, og cellulær-matriks-vekselvirkninger. Således, organkulturteknikker er særlig nyttige for å undersøke de komplekse biologiske mekanismer for IVD. Her beskriver vi en høy gjennomstrømming tilnærming for dyrking hele korsrygg mus FSU som gir en ideell plattform for å studere sykdomsmekanismer og terapier for IVD. Videre beskriver vi several applikasjoner som benytter denne organkultur-metoden for å gjennomføre ytterligere studier, inkludert kontrastforsterket avbildning microCT og tredimensjonale høy oppløsning endelig elementmodellering av IVD.
Introduction
Ryggsmerter (LBP) er den ledende faktor for global funksjonshemming og tapt produktivitet på arbeidsplassen, og amerikanerne alene bruker i overkant av 50 milliarder dollar på LBP behandling 1. Selv utbredt, forblir etiologien av LBP kompleks og multifaktoriell. Imidlertid er mellomvirvelskive (IVD) degenerasjon blant de mest betydelige risikofaktorer for LBP 2.
IVD består av tre mikrostrukturer: det ytre ringrommet fibrosis (AF), den indre nucleus pulposus (NP), og to endeplater brusk denne sandwich hele strukturen proksimalt og distalt 3. Med aldring og degenerasjon, IVD komponentene endres strukturelt, sammensetningsmessig og mekanisk 4. Disse endringene omfatter tapet av proteoglykaner og hydrering i NP, redusert skivehøyde, og svekket mekanisk kompetanse 5. Disse endringene erofte ledsaget av cytokiner som fremmer en inflammatorisk respons, så vel som nøytrofil og dorsalrotganglion inntrengning i leddrommet som kulminerer i en kaskade av hendelser som fører til LBP symptomer 6.
Å studere mekanismene for IVD degenerasjon er utfordrende hos mennesker, fordi det ofte ikke er mulig å isolere årsaken til degenerasjon før forekomsten av ryggsmerter. Således, en reduksjonistisk tilnærming for å forenkle den eksperimentelle system ned til IVD organ tillater mekanistisk finjustering av årsaksvariabler og undersøke deres nedstrøms effekter 5. Systemet er redusert til bare den opprinnelige cellepopulasjon og omgivende ekstracellulær matriks, slik at den direkte tolkning av virkninger av eksterne stimuli på IVD degenerasjon. Videre er den lavere pris og skalerbarhet av murine modeller, så vel som det store antall av genetisk modifiserte dyr 7, gi rom for than rask målrettet screening av IVD degenerative mekanismer og mulige behandlinger. Her beskriver vi et murint organkultursystem i hvilket IVD cellulær og vev stabilitet blir opprettholdt i løpet av 21 dager, med spesiell vekt gitt til IVDs' homeostatiske, mekaniske og strukturelle, og inflammatoriske mønstre. Ved hjelp av denne metode, overvåker vi IVDs' funksjonelle forandringer i en stikk-indusert skade-modell 8 for å forstå mekanismene bak platen degenerasjon. Videre beskriver vi en rekke anvendelser av denne organkultur-metoden for å gjennomføre ytterligere studier, inkludert kontrastforsterket avbildning microCT og tredimensjonale høy oppløsning modellering av IVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en organkultur av den murine FSU med vekt på å kartlegge de biologiske endringer i IVD. Den vellykkede vedlikehold av disse kulturene krever nøye sterile teknikker. Spesielt disseksjonen trinn 2,1-2,6 og dyrkningstrinnene 3,1-3,6 krever spesiell omsorg for å sikre sterile betingelser blir opprettholdt, og denne fremgangsmåten skal utføres fortrinnsvis i et isolert rom prosedyre med et HEPA luftmengde for å minimalisere forurensning. Fordi disseksjon pro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Washington University i muskler Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056), Mechanobiology Trening Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, og NIH K01AR069116. Forfatterne ønsker å takke Patrick Wong for hans bidrag i datainnsamling.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Referências
- Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
- Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).
- Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).
- Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).
- Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).
- Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).
- Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).
- Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).
- Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
- Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
- Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116 (12), (2014).
