En<em> In Vitro</em> Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan
Summary
Helt organ kultur av mellankotskivan (IVD) bevarar den nativa extracellulära matrisen, cellfenotyper, och cellulär-matrisinteraktioner. Här beskriver vi ett IVD kultur system med musen ländryggen och stjärt IVDs i deras funktionella ryggradsenheter och flera program som använder detta system.
Abstract
Mellankotskiva (IVD) degeneration är en signifikant bidragsgivare till ländryggssmärta. IVD är en fibrocartilaginous gemensamma som tjänar till att sända och dämpa laster i ryggraden. IVD består av en proteoglykan-rika nucleus pulposus (NP) och ett kollagenrikt annulus fibrosis (AF) infogad broskgavelplåtarna. Tillsammans med de intilliggande ryggkotorna, bildar ryggkotorna-IVD-struktur en funktionell ryggradsenhet (FSU). Dessa mikro innehåller unika celltyper samt unika extracellulära matriser. Helt organ kultur av FSU bevarar den nativa extracellulära matrisen, celldifferentierings fenotyper, och cellulär-matrisinteraktioner. Sålunda, organkulturtekniker är särskilt användbara för att undersöka de komplexa biologiska mekanismerna i IVD. Här beskriver vi en hög genomströmning metod för odling av hela ländryggen musen FSU som ger en idealisk plattform för att studera mekanismer och terapier sjukdoms för IVD. Dessutom beskriver vi several applikationer som utnyttjar denna organkultur metod att utföra ytterligare studier inkluderande kontrastförstärkt microCT avbildning och tredimensionella hög upplösning finita element modellering av IVD.
Introduction
Ländryggssmärta (LBP) är den viktigaste faktorn för global funktionshinder och förlorad produktivitet på arbetsplatsen, och amerikaner ensam tillbringar mer än 50 miljarder dollar på LBP behandling 1. Även förhärskande, etiologi LBP förblir komplex och multifaktoriell. Dock är intervertebral skiva (IVD) degeneration bland de viktigaste riskfaktorerna för LBP 2.
IVD är gjord av tre mikrostrukturer: den yttre annulus fibrosis (AF), varvid den inre kärnan pulposus (NP), och två broskartade ändskivorna som omsluter hela strukturen proximalt och distalt 3. Med åldrande och degeneration, de IVD komponenterna förändras strukturellt, sammansättningsmässigt, och mekaniskt 4. Dessa förändringar innefattar förlusten av proteoglykaner och hydratisering i NP, minskade skivans höjd, och försämrade mekaniska kompetens 5. Dessa förändringar ärofta tillsammans med cytokiner som främjar ett inflammatoriskt svar, liksom neutrofila och dorsala ganglion intrång i det gemensamma utrymmet som kulminerade i en kaskad av händelser som leder till LBP symptom 6.
Studera mekanismerna för IVD degeneration är en utmaning för människor eftersom det ofta inte är möjligt att isolera orsaken till degeneration innan förekomsten av ländryggssmärta. Således ett reduktionistiskt tillvägagångssätt förenkla experimentella systemet ner till IVD organ tillåter mekanistiska finjustering av orsaksvariabler och undersöka deras nedströms effekter 5. Systemet reduceras till endast den nativa cellpopulationen och omgivande extracellulära matrisen, vilket således möjliggör direkt tolkning av effekterna av yttre stimuli på IVD degeneration. Dessutom den lägre kostnaden och skalbarhet av murina modeller, liksom det stora antalet genetiskt modifierade djur 7, medger than snabb riktad screening av IVD degenerativa mekanismer och potentiella behandlingar. Här beskriver vi en murin organkultursystem i vilket IVD cellulära och vävnadsstabilitet bibehålls över 21 dagar, med särskild fokusering på IVDs' homeostatiska, mekaniska, strukturella, och inflammatoriska mönster. Med denna metod, vi övervaka IVDs funktionella förändringar i ett hugg-inducerad skada modell 8 för att förstå mekanismerna bakom diskdegeneration. Dessutom beskriver vi flera tillämpningar av denna organkultur metod att genomföra ytterligare studier inklusive kontrastförstärkt microCT avbildning och tredimensionella hög upplösning modellering av IVD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver ett organ kultur mus FSU med tonvikt på övervakning av biologiska förändringar i IVD. Den framgångsrika underhåll av dessa kulturer kräver noggranna sterila tekniker. I synnerhet, steg dissektion 2,1-2,6 och kulturen steg 3,1-3,6 kräver särskild omsorg för att säkerställa sterila förhållanden upprätthålls, och dessa steg bör utföras företrädesvis i en isolerad förfarande rum med ett HEPA luftflöde för att minimera föroreningar. Eftersom d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Washington University Musculoskeletal Research Center (NIH P30 AR057235), Molecular Imaging Center (NIH P50 CA094056) Mechanobiology Training Grant (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804 och NIH K01AR069116. Författarna vill tacka Patrick Wong för sina insatser i datainsamling.
Materials
| 96 well plate | Midwest Scientific | TP92096 | Used for biochemical assays |
| 24 well plate | Midwest Scientific | TP92024 | Used for organ culture |
| 25 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94024 | Used for organ culture |
| 10 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94010 | Used for organ culture |
| 5 ml pipettes | Midwest Scientific | TP94005 | Used for organ culture |
| 500 ml bottle top filters, 22um | Midwest Scientific | TP99505 | Used for filter media |
| 10 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140098 | Used for biochemical assays |
| 200 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140900 | Used for biochemical assays |
| 1000 ul pipette tips | Midwest Scientific | NP89140920 | Used for biochemical assays |
| DMEM /F-12 | Invitrogen | 11330032 | Used for culture media |
| Optiray 350 | Guebert | 19133341 | Used for contrast enhanced microCT |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F2442 | Used for culture media |
| Penicillin Streptomycin | Sigma | P4333 | Used for culture media |
| Tetrazolium Blue Chloride | Sigma | T4375 | Used for biochemical assays |
| D-Luciferin | Sigma | L6152 | Used for bioluminescence imaging |
| Chondroitin Sulfate | Sigma | C9819 | Used for biochemical assays |
| 10% Phosphomolybdic Acid Solution | Sigma | HT152 | Used for contrast enhanced microCT |
| Safranin O | Sigma | S8884 | diluted to .1% concentration (in water) |
| Fast Green FCF | Sigma | F7258 | .001% concentration |
| Papain from papaya latex | Sigma | P3125 | Used for biochemical assays |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleic acid staining |
| Cyanoacrylate Glue | Loctite | 234790 | Adhesive |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | Fischer Scientific | S348903 | Used for biochemical assays |
| Big Equipment | |||
| BioDent | ActiveLife | For mechanical testing | |
| Cytation 5 | Biotek | Spectrophotometer | |
| AxioCam503 | Carl Zeiss AG | Microscope | |
| VivaCT40 | Scanco | MicroCT | |
| Analytical balance | Denver Instrument Company | A-200DS | Analytical balance |
| Incubator HERAcell 150i | Thermo Scientific | Organ Culture | |
| Dissection Scope | VistaVision | Used during dissection | |
| Laser Micrometer | Keyence | LK-081 | Measuring disc height |
| Microcentrifuge 5810 R | Eppendorf | Used for biochemical assays | |
| Microtome | Leica | RM2255 | Used for histology |
| Software | |||
| Prism 7 | GraphPad | For statistics | |
| MATLAB R2014a | Mathworks | For modeling | |
| Osiri-LXIV | Pixmeo | Open Source | |
| MeshLab v1.3.3 | Visual Computing Lab – ISTI – CNR | Open Source | |
| PreView/FEBio 2.3 | Utah MRL & Columbia MBL | Open Source | |
| ImageJ | NIH | ||
| Microsoft Excel | Windows | ||
| Dissection Tools | |||
| Cohan-Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-02 | Or any nice pair of spring scissors |
| Fine Scissors – Sharp (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Fine Scissors – Sharp (larger) | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-40 | At least 2; can also use #3 |
| Extra Fine Graefe Forceps, serrated | Fine Science Tools | 11150-10 | At least 2 |
| Micro-Adson Forceps, serrated | World Precision Instruments | 503719-12 | |
| Micro-Adson Forceps, teeth | World Precision Instruments | 501244 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Scalpel Blades – #23 | Fine Science Tools | 10023-00 | |
| Insect Pins , size 000 | Fine Science Tools | 26000-25 | |
| 27G Needle | BD PrecisionGlide Needles | BD305109 |
Referências
- Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally. Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).
- Urban, J., Roberts, S. Degeneration of the intervertbral disc. Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).
- Mirza, S. K., White, A. A. Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease. J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).
- Acaroglu, E. R., et al. Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus. Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).
- Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model. J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).
- Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models. Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).
- Pelle, D. W., et al. Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Zhang, H., et al. Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine. J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).
- Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing. J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).
- Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs. J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).
- Pasparakis, M. Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases. Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).
- O’Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry. Spine. 32 (3), 328-333 (2007).
- Lee, C. R., et al. In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies. Spine. 31, 515-522 (2006).
- Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture. J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).
- Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice. J Appl Physiol. 116 (12), (2014).
