יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting
Summary
פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials, באמצעות תאים בלבד. Cardiomyocytes, תאים אנדותל fibroblasts מבודדים הראשון, נספר ומעורב ביחסים התא הרצוי. הם שיתוף תרבותי בארות בודדים נמוך מאוד מצורף 96-טוב צלחות. תוך 3 ימים, להכות בצורת spheroids. אלה spheroids אז הרימו ידי זרבובית באמצעות יניקה ואקום התאספו על מערך מחט באמצעות bioprinter 3D. את spheroids מותר אז כדי fuse על מחט מערך. שלושה ימים לאחר bioprinting 3D, spheroids מוסרים כתיקון שלם, אשר כבר ספונטני מכות. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.
Introduction
ישנן שיטות רבות ושונות של 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting מסווגת לעתים קרובות על ידי טכנולוגיית הדפסה 1 , עם דוגמאות כגון bioprinting דיו, biocrinting microextrusion, לייזר בסיוע bioprinting, שילוב של שיטות, או גישות חדשות יותר. 3D bioprinting יכול גם להיות מסווגים לתוך ללא פיגומים או שיטות פיגום תלוי 4 . רוב השיטות של bioprinting 3D הם תלויים פיגום, שם יש צורך biomaterials, למשל ביוינקים 5 או פיגומים 6 . עם זאת, תלוי 3D פיגום bioprinting פנים בעיות רבות ומגבלות 4 , 7 , כגון immunogenicity של חומר פיגום, עלות bioinks קניינית, מהירות איטית ורעילות של השפלה מוצרים.
סקאףהנדסת רקמת לב ללא קפל באמצעות spheroids כבר ניסה 8 , עם פוטנציאל להתגבר על החסרונות האלה של הנדסת רקמות תלוי פיגום. עם זאת, כפי שהוכיחו על ידי המחברים באותו נייר, זה היה קשה לטפל בחוזקה מיקום spheroids במקומות קבועים, בתהליך של biofabrication. השימוש המלווה של bioprinting 3D ו הנדסת רקמות מבוסס spheroid יש פוטנציאל להתגבר על קשיים אלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים bioprinting 3D של רקמת לב ללא biomaterials אחרים, תוך שימוש רק בתאים בצורת spheroids.
פיגומים מבוססי spheroid מבוססי spheroid 3D יש את היכולת להרים spheroids בודדים באמצעות שאיבה ואקום ולמקם אותם על מערך מחט. הרעיון של מיקום spheroids על מערך מחט ב bioprinting 3D, הוא בהשראת השימוש של מערכי מחט (המכונה " קנזאן ") של Japa העתיקהNese, אומנות, סידור פרחים, ikebana. מערכת זו מאפשרת spheroids להיות ממוקם במדויק בכל תצורה ותוצאות הספירואידים הפרט fusion יחד לאורך תקופה קצרה כדי ליצור רקמות bioprinted 3D. שיטה זו מאפשרת spheroids להיות מניפולציה בקלות, עם השלכות פוטנציאליות לעתיד של ביו-אפורציה אורגנית ללא פיגום.
Protocol
Representative Results
Discussion
It is important to use beating, functional spheroids for 3D bioprinting. If spheroids are not beating, continuing to use them will invariably result in a non-functional 3D bioprinted patch.
One benefit of this approach is the ability to manipulate the cell content of the patch by varying the total number of cells and the percentage of cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts in the spheroids. This allows for many different types of cardiac patches to be printed, with varying histolog…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מאשרים את מקורות המימון הבאים: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research ו- Maryland Stem Cell Research Research (2016-MSCRFI-2735).
Materials
| Geltrex | Invitrogen | A1413202 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Defined Trypsin inhibitor 0.0125% | Thermo Fisher | R007100 | |
| RPMI Cell Media | Invitrogen | 11875-093 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher | 17504044 | RPMI supplemented with B27 constitutes HIPSC-CM culture media |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| Human cardiac fibroblasts (adult ventricular type) | Sciencell | 6310 | |
| Human umbilical vein endothelial cells | Lonza | CC-2935 | |
| PrimeSurface ultra-low attachment 96-well U-bottom plates | Akita Sumitomo Bakelite Co. | MS-9096UZ | |
| Regenova Bio 3D Printer | Cyfuse Biomedical K.K. | N/A | www.cyfusebio.com/en/ |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher | 15250061 | |
| Troponin T Antibody | Thermo Fisher | 701620 | |
| Connexin 43 (Cx43) Antibody | Chemicon | MAB3068 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher | P36935 |
Referências
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).
- Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. 3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine. Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).
- Patra, S., Young, V. A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue. Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).
- Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting. Tissue Eng Part B Rev. , (2017).
- Cui, X., Boland, T., D’Lima, D. D., Lotz, M. K. Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine. Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).
- Murphy, C. M., Haugh, M. G., O’Brien, F. J. The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering. Biomater. 31, 461-466 (2010).
- Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomater. 30, 2164-2174 (2009).
- Itoh, M., et al. Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae. PloS One. 10, e0136681 (2015).
- Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).
- Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release. Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).
- Boheler, K. R., et al. A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets. Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).
- ScienCell Research Laboratories. . Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet. , (2017).
- Lonza Walkersville, Inc. . Endothelial Cell Systems – Technical Information & Instructions.,. , (2015).
- Thermo Fisher Scientific, Inc. . Immunofluorescence Method for IHC Detection. , (2017).
- Murata, D., et al. A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J Orthop Surg Res. 10, (2015).
- Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomed Mater. 10, 034002 (2015).
- Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies. J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).
- Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review. International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).
