Оценка жизнеспособности нейронов с помощью двойного окрашивания флуоресцеина диацетат-пропидиум в культуре нейробных гранул мозжечка
Summary
Этот протокол описывает, как точно измерить жизнеспособность нейронов с использованием двойного окрашивания флуоресцеина диацетата (FDA) и пропидиум-йодида (PI) в культивируемых нейронах гранул мозжечка, первичной нейрональной культуре, используемой в качестве модели in vitro в исследованиях нейронауки и нейрофармакологии.
Abstract
Первичные культивируемые мозжечковые гранулы нейронов (CGNs) широко используются в качестве модели in vitro в исследованиях нейрофизиологии и нейрофармакологии. Однако сосуществование глиальных клеток и нейронов в культуре CGN может привести к искажениям в точной оценке жизнеспособности нейронов. Двойное окрашивание флуоресцеина диацетата (FDA) и пропидий-йодида (PI) используется для измерения жизнеспособности клеток путем одновременной оценки жизнеспособных и мертвых клеток. Мы использовали двойное окрашивание FDA-PI для улучшения чувствительности колориметрических анализов и оценки жизнеспособности нейронов в CGN. Кроме того, мы добавили синие флуоресцентные пятна ДНК ( например, Hoechst) для улучшения точности. Этот протокол описывает, как улучшить точность оценки жизнеспособности нейронов, используя эти методы в культуре CGN. Используя этот протокол, количество глиальных клеток может быть исключено с помощью флуоресцентной микроскопии. Аналогичная стратегия может быть применена, чтобы отличить нежелательные глиAl клетки из нейронов в различных культурах смешанных клеток, таких как первичная корковая культура и культура гиппокампа.
Introduction
Анализы колориметрической цитотоксичности, такие как анализ 3- (4, 5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2-Н-тетразолийбромид (МТТ), обычно используют для определения жизнеспособности клеток in vitro . Первичные культивируемые мозжечковые гранулы нейронов (CGN) у крыс чувствительны к различным нейротоксинам, включая ион 1-метил-4-фенилпиридиния, перекись водорода и глутамат 1 , 2 . Таким образом, культуры CGN могут использоваться как модель in vitro в области нейронауки. Культуры CGN могут содержать различные клетки, включая нейроны и глиальные клетки, которые могут составлять около 1% от общего количества клеток в культуре CGN. Однако глиальные клетки по-разному реагируют на нейротоксины по сравнению с нейронами, что приводит к смещению в жизнеспособности нейронов, измеренному колориметрическими анализами 3 .
В жизнеспособных клетках диацетат флуоресцеина (FDA) может быть превращен в флуоресцеин эстеразой.Пропидий-йодид (PI) может взаимодействовать с ДНК после проникновения в мертвые клетки и может использоваться для указания апоптоза в культуре. Таким образом, двойное окрашивание FDA-PI может одновременно оценивать жизнеспособные клетки и мертвые клетки, предполагая, что жизнеспособность клеток может быть измерена более точно, комбинируя оба колориметрических метода. Более того, путем добавления Hoechst, синего флуоресцентного красителя для ядер, точность жизнеспособности клеток может быть дополнительно улучшена. Представленный здесь протокол описывает двойное окрашивание FDA-PI и тройное окрашивание FDA-PI-Hoechst, которое может быть использовано для точного анализа жизнеспособности нейронов в первичных культивируемых CGN.
Этот протокол использует преимущества визуализации и различения CGN и глиальных клеток по их различным размерам и формам. После окрашивания число жизнеспособных нейронов и мертвых нейронов подсчитывают из репрезентативных изображений, полученных с помощью флуоресцентной микроскопии. Крупные глиальные клетки исключаются путем сравнения типичных CGNs tAken под флуоресцентным режимом с режимами фазового контраста. Подобная стратегия может быть выполнена для измерения жизнеспособности нейронов в смешанных клеточных культурах, содержащих нейроны и глиальные клетки, такие как первичные корковые культуры и культуры гиппокампа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол был изменен из процедур, которые были описаны ранее 6 , 7 . Исследователи потратили время, пытаясь уменьшить рост нейрональных клеток, улучшая условия культивирования первичных нейронов in vitro 8 . Однако даже при улучшенных ус…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами Фонда естественных наук провинции Чжэцзян (LY15H310007), Проекта прикладных исследований некоммерческой технологии провинции Чжэцзян (2016C37110), Национального фонда естественных наук Китая (U1503223, 81673407), Нинбо Международной науки и Проект по технологическому сотрудничеству (2014D10019), Муниципальная инновационная группа по науке и здоровью Нинбо (2015C110026), Провинциальный проект по науке и технике провинции Гуандун (№ 2013B051000038), Программа научных исследований Шэньчжэня (JCYJ20160331141459373), Гуандун-Хонг (GHP / 012 / 16GD), Совет исследовательских грантов Гонконга (15101014), Гонконгский политехнический университет (G-YBGQ) и Фонд К.С.Вонга Магна в Университете Нинбо.
Materials
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside | Sigma | C1768 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10099141 | high quality FBS is essential for culture |
| 100× glutamine | Gibco | 25030081 | |
| 100× anti-biotic | Gibco | 15240062 | |
| BME medium | Gibco | 21010046 | |
| Fluorescein diacetate | Sigma | F7378 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | |
| Hoechst 33342 | Yesen | 40731ES10 | |
| rabbit Anti-GAP43 antibody | Abcam | ab75810 | |
| mouse Anti-GFAP antibody | Cellsignaling | 3670 | |
| Bovine serum albumin | Sangon Biotech | A602440 | |
| Trypsin | Sigma | T4665 | |
| DNAse | Sigma | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9003 | |
| Pasteur pipette | Volac | Z310727 | burn the tip round before use |
| 12-well cell culture plates | TPP | Z707783 | |
| 6-well cell culture plates | TPP | Z707759 | high quality cell culture plate is essential for culture |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | |
| Pipet 5 ml | Excell Bio | CS017-0003 | |
| Pipet 10 ml | Excell Bio | CS017-0004 | |
| Dissect microscope | Shanghai Caikang | XTL2400 | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 311 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | TI-S | |
| Fluorescence filter and emmision cubes | Nikon | B-2A, G-2A, UV-2A | |
| Photo software | Nikon | NIS-Elements | |
| Graphics editor softeware | Adobe | Photoshop CS | |
| Image process softeware | NIH | ImageJ |
Referências
- Yu, J., et al. Indirubin-3-oxime prevents H2O2-induced neuronal apoptosis via concurrently inhibiting GSK3beta and the ERK pathway. Cell Mol Neurobiol. , (2016).
- Cui, W., et al. The anti-cancer agent SU4312 unexpectedly protects against MPP(+) -induced neurotoxicity via selective and direct inhibition of neuronal NOS. Br J Pharmacol. 168 (5), 1201-1214 (2013).
- Jebelli, J., Piers, T., Pocock, J. Selective Depletion of Microglia from Cerebellar Granule Cell Cultures Using L-leucine Methyl Ester. J Vis Exp. (101), e52983 (2015).
- Labno, C. . Two way to count cells with ImageJ. , (2008).
- Haag, D., et al. Nos2 Inactivation promotes the development of medulloblastoma in Ptch1(+/-) mice by deregulation of Gap43-dependent granule cell precursor migration. Plos Genet. 8 (3), e1002572 (2012).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), e990 (2009).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Li, W., et al. Novel dimeric acetylcholinesterase inhibitor bis7-tacrine, but not donepezil, prevents glutamate-induced neuronal apoptosis by blocking N-methyl-D-aspartate receptors. J Biol Chem. 280 (18), 18179-18188 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Cheung, G., Cousin, M. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM Dyes. J Vis Exp. (57), e3143 (2011).
- Atlante, A., et al. Genistein and daidzein prevent low potassium-dependent apoptosis of cerebellar granule cells. Biochem Pharmacol. 79 (5), 758-767 (2010).
- Silva, R., Rodrigues, C., Brites, D. Rat cultured neuronal and glial cells respond differently to toxicity of unconjugated bilirubin. Pediatr Res. 51 (4), 535-541 (2002).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Garner, D. L., Johnson, L. A. Viability Assessment of Mammalian Sperm Using Sybr-14 and Propidium Iodide. Biol Reprod. 53 (2), 276-284 (1995).
