Analyse de terminaison de la transcription Utilisation d'exécution sur la transcription (TRO) Approche BrUTP brin spécifique
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
Ce manuscrit décrit un protocole de détection de terminaison de la transcription défaut in vivo. Le protocole TRO spécifique de brin en utilisant BrUTP décrit ici est une approche expérimentale puissante pour analyser le défaut de terminaison de transcription dans des conditions physiologiques. Comme le dosage TRO traditionnel, il repose sur la présence d'une polymerase transcriptionnellement actif au – delà de l' extrémité 3 'du gène comme un indicateur d'un défaut de terminaison de transcription 1. Il surmonte deux problèmes majeurs rencontrés avec le dosage de la TRO traditionnelle. Tout d'abord, il peut détecter si la polymerase lecture par le signal de terminaison est celui qui a initié la transcription de la région promotrice-proximale, ou si elle est simplement représente une polymérase transcrivant pervasively qui a initié de façon non spécifique de quelque part dans le corps ou la région 3 ' du gène. D'autre part, on peut distinguer si le signal de polymerase transcriptionnellement actif au-delà de larégion de terminaison est vraiment la polymérase transcrivant un ARNm sens translecture ou un signal d'ARN anti-sens non codant terminateur initiée. En bref, le protocole implique perméabilisation des cellules de levure en croissance exponentielle, ce qui permet la transcription initiatrices in vivo allongé en présence du nucleotide BrUTP, la purification de l' ARN BrUTP marqué par l'approche par affinité, la transcription inverse de l'ARN naissant purifié et l' amplification de l'ADNc en utilisant des amorces spécifiques à brin flanquant le promoteur et les régions terminatrices du gène 2.
Introduction
Le cycle de transcription eucaryote se compose de trois étapes principales; initiation, l'élongation et la terminaison. La terminaison de la transcription par l' ARN polymérase II se compose de deux étapes interdépendantes distinctes 3. La première étape implique le clivage, la polyadénylation et la libération de l'ARNm à partir du modèle, et est immédiatement suivie par la seconde étape, marquée par le désengagement de la polymérase du modèle. Terminaison appropriée est cruciale pour le recyclage de la polymérase lors de l' initiation / réinitiation de la transcription, pour empêcher l' interférence avec la transcription des gènes en aval, et pour garder la transcription aberrante dans le contrôle en limitant la transcription de l' ARN omniprésente 4, 5 non codante. Malgré les progrès récents, la résiliation est de loin l'étape la moins comprise du cycle de transcription de l'ARN polymérase II. Un test de terminaison fiable est essentielle pour étudier le mécanisme underlying terminaison de la transcription par l' ARN polymérase II in vivo.
Un certain nombre d'approches expérimentales sont utilisées pour détecter le défaut d'interruption dans un gène transcrivant activement dans des conditions physiologiques. Ceux-ci comprennent Northern blot, le facteur de terminaison ChIP (Immunoprécipitation de la chromatine) et le dosage de la TRO traditionnelle. Chacune de ces techniques présentent des avantages et des inconvénients. L'essai de TRO traditionnel utilisé pour être l'approche la plus fiable et sensible pour la détection d'un défaut de terminaison de la transcription in vivo 1. Ce dosage se localise les molécules de polymerase transcriptionnellement actif sur différentes régions d'un gène dans la cellule. Dans des conditions normales, l'essai montre des molécules de polymerase transcriptionnel engagés strictement répartis entre la région promoteur et le terminateur du gène (figure 1A). En cas de résiliation défectueux, cependant, la polymérase est incapable de lire le signal de terminaisonet est détecté dans la région en aval de l'extrémité 3 ' du gène (figure 1B).
Un défaut de terminaison de la transcription se manifeste en présence d'une polymérase des sens de transcription qui a initié à partir de la région du promoteur proximal et étant incapable de lire le signal de terminaison, continue transcrivant la région en aval de l' extrémité 3 'd'un gène tel que représenté sur la figure 2A. Avec la prise de conscience que le génome eucaryote présente transcription omniprésente écrasante dans le sens ainsi que les directions anti-sens dans et autour d' un gène 6, 7, 8, 9, 10, il est vite devenu clair que le dosage de la TRO traditionnelle ne peut pas détecter si le signal de la polymérase en aval d'un gène représente la transcription du promoteur initié (figure 2A) ou un ARN aberrant qui a initié somewhere au milieu du gène ou en aval de l'élément de terminaison (figure 2B) ou la transcription de la polymerase dans le sens anti-sens de l' extrémité 3 'du gène (figure 2C). Le TRO dosage spécifique de brin en utilisant BrUTP décrit ici peut distinguer si le signal de la polymérase translecture observée représente promoteur initiée sens large ARNm ou une transcription anti-sens qui a initié en aval du gène en cours d'examen. Nous avons utilisé avec succès cette approche pour démontrer le rôle de Kin28 kinase dans terminaison de la transcription dans la levure bourgeonnante 2. Employant l'approche ici nous montrons que Rna14 est nécessaire pour la terminaison de la transcription du ASC1 dans la levure bourgeonnante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole TRO spécifique de brin utilisé ici a été adapté du protocole utilisé pour GRO-Seq (Global Run On-Sequencing) analyse dans les cellules de mammifères 12. Nous avec succès le protocole modifié pour étudier la transcription naissante dans la levure bourgeonnante. Pour analyser précisément le défaut de terminaison de transcription, nous avons ajusté le protocole additionnel en se débarrassant de l'étape d'hydrolyse de l'ARN. Cela nous a permis de détecter sp?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Referências
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