BrUTP本鎖特異的転写ランオン（TRO）のアプローチを使用した転写の終結の分析
Summary
We describe a basic experimental approach for analysis of termination of transcription by RNA polymerase II in vivo using BrUTP by the strand-specific transcription run-on (TRO) approach in budding yeast. This protocol can be extended to study transcription termination by other RNA polymerases both in yeast and higher eukaryotes.
Abstract
この原稿は、 インビボで転写終結欠陥を検出するためのプロトコルを記述しています。 BrUTPを使用して本鎖特異的TROプロトコルは、ここで説明する生理学的条件下で転写終結欠陥を分析するための強力な実験的アプローチです。伝統的なTROアッセイと同様に、転写終結欠陥1の指標として遺伝子の3 '末端を越えて転写的に活性なポリメラーゼの存在に依存しています。これは、従来のTROアッセイで遭遇する二つの主要な問題を克服します。終結シグナルを読んポリメラーゼがプロモーター近位領域からの転写を開始したものであれば第一に、それを検出することができ、またはそれは単にどこか身体または3 '内から非特異的に開始した広範囲に転写ポリメラーゼを表している場合遺伝子の末端。第二に、超えた場合に転写活性ポリメラーゼ信号を区別することができますターミネーター領域は、真に読み通しセンスmRNAの転写ポリメラーゼまたはターミネーターが開始非コードアンチセンスRNAの信号です。簡単に言えば、プロトコルは、精製された新生RNAを転写し、使用してcDNAを増幅する逆、指数関数的に増殖する酵母細胞を透過性BrUTPヌクレオチドの存在下で伸長するためにインビボで開始される転写を可能にする、親和性アプローチによってBrUTP標識RNAを精製することを含みますプロモーターと遺伝子2のターミネーター領域に隣接する鎖特異的プライマー。
Introduction
真核生物の転写サイクルは、次の3つの主要手順で構成されています。開始、伸長および終結。 RNAポリメラーゼIIによる転写の終結は、2つの異なる、相互に依存する手順3で構成されています。最初のステップは、テンプレートからの切断、ポリアデニル化およびmRNAの放出を伴う、とすぐにテンプレートからのポリメラーゼの離脱によってマーク第二段階が続きます。適切な終端は、転写の開始/再開時のポリメラーゼのリサイクルのため、下流の遺伝子の転写との干渉を防止するため、および広汎非コードRNA 4、5の転写を制限することによって、チェックで異常な転写を維持するために不可欠です。最近の進歩にもかかわらず、終了ははるかにRNAポリメラーゼII転写サイクルの少なくとも理解のステップです。信頼性の高い終端アッセイは、メカニズムを研究するために不可欠であるunderlyinin vivoでの RNAポリメラーゼIIによる転写のグラム終結。
実験的アプローチの数は、生理的条件下で活発に転写遺伝子に終止欠陥を検出するために使用されます。これらには、ノーザンブロット、終結因子チップ（クロマチン免疫沈降）、伝統的なTROアッセイが含まれます。これらの技術のそれぞれは、いくつかの利点と欠点を有します。伝統的なTROアッセイは、 インビボ 1 における転写終結の欠陥を検出するための最も信頼性の高い敏感なアプローチに使用されます。このアッセイは、細胞内の遺伝子の異なる領域に転写活性のポリメラーゼ分子を局在化します。通常の条件下では、アッセイは、厳密遺伝子（ 図1A）のプロモーター及びターミネーター領域との間で分配転写係合ポリメラーゼ分子を示します。不良終了時に、しかし、ポリメラーゼは、終了信号を読み取ることができません遺伝子（ 図1B）の3 '末端の下流の領域で検出されます。
転写終結欠陥がプロモーター近位領域から開始センス転写ポリメラーゼの存在下で明らかにし、終了信号を読み取ることができないされ、 図に示すように、遺伝子の3 '末端の下流の領域を転写続けます2A。真核生物のゲノムおよび遺伝子6、7、8、9、10の周りに圧倒的な普及意味で転写、ならびにアンチセンス方向を示す実現して、それはすぐに従来のTROアッセイは検出できないことが明らかになったポリメラーゼIF信号遺伝子の下流には、プロモーター、開始転写産物（ 図2A）またはSOMを開始した異常なRNAを表し、遺伝子またはターミネーター要素（ 図2B）、または遺伝子（ 図2C）の3 '末端からアンチセンス方向のポリメラーゼ転写の下流の途中でewhere。観察されたリードスルーポリメラーゼ信号がプロモーターで開始さ拡張センスmRNAまたは検査中の遺伝子の下流を開始したアンチセンス転写物を表す場合は使用してBrUTPは、ここで説明する本鎖特異TROアッセイは、区別することができます。我々は成功した酵母2出芽における転写の終結でKin28キナーゼの役割を実証するために、このアプローチを使用しています。ここでのアプローチを採用我々はRna14は出芽酵母におけるASC1の転写の終結のために必要とされていることを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで使用される本鎖特異的TROプロトコルは、哺乳動物細胞12にGRO-のSeq（グローバルランオンシークエンシング）分析のために使用されるプロトコルから適応されました。我々は成功し、出芽酵母において新生転写を研究するためのプロトコルを変更しました。具体的には転写終結欠陥を分析するために、我々は、RNAの加水分解工程を取り除くことにより、更なるプロトコ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in Ansari lab was supported by the research grant (No. MCB 1020911) from National Science Foundation.
Materials
| Phenol -chloroform-isoamyl alcohol mixture | Sigma-Aldrich | 77619 | pH 4-5 |
| TRIzol reagent | Life technologies | 15596-026 | |
| RNase Inhibitor, human placenta | New England Biolabs | M0307S | |
| Anti-BrdU beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-32323AC | |
| Protoscript II | New England Biolabs | M03368L | or an equivalent enzyme |
| Advantage 2 polymerase Mix | Clontech | 639201 | or an equivalent enzyme |
| 5-Bromouridine 5' triphosphate sodium salt | Santa Cruz Biotechnology | sc-214314A | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| ATP | New England Biolabs | N0451AA | |
| CTP | N0454AA | ||
| GTP | N0452AA | ||
| Ultra-pure bovine serum albumin (BSA) | MC Labs | UBSA-100 | |
| Asc1 B | AGATTCGTCGGTCACAAGTCC | ||
| Asc1 C | GAACTTTATACATATTCTTAGTT AGCAGTC |
||
| Asc1 D | TGTACATATGTATTTTCGCAGCA | ||
| Asc1 E | GCCAAGGAGACTGAATTTAATG | ||
| Asc1 F | CTATGGAATGGGGGTTTTAAG | ||
| Asc1 G | GGTTATGGCAGACATGCCAC | ||
| 5s cDNA | AGATTGCAGCACCTGAGT | ||
| 5’ 5s reverse | GGTTGCGGCCATATCTAC | ||
| 3’ 5s reverse | TGAGTTTCGCGTATGGTC |
Referências
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