Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie
Summary
Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 + -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird.
Abstract
Die Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) ist in Kombination mit chemischen Clearing-Protokollen zum Goldstandard für die Analyse fluoreszenzmarkierter Strukturen in großen biologischen Proben geworden und liegt in der zellulären Auflösung. Mittlerweile ermöglichen die ständige Verfeinerung der zugrunde liegenden Protokolle und die erweiterte Verfügbarkeit von spezialisierten kommerziellen Systemen die Untersuchung der Mikrostruktur ganzer Mausorgane und ermöglichen sogar die Charakterisierung des zellularen Verhaltens in verschiedenen lebenszykologischen Bildgebungsansätzen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die räumliche Vollmontage Visualisierung und Quantifizierung der CD45 + Leukozytenpopulation in entzündeten Mausherzen. Das Verfahren verwendet einen transgenen Mausstamm (CD11c.DTR), der vor kurzem als ein robustes, induzierbares Modell für die Untersuchung der Entwicklung einer fulminanten tödlichen Myokarditis, gekennzeichnet durch tödliche Herzrhythmusstörungen, gezeigt wurde. Dieses Protokoll enthält Myokarditis Induktion, intravitAl-Antikörper-vermittelte Zellfärbung, Organpräparation und LSFM mit anschließender computergestützter Bildnachbearbeitung. Obwohl es als hoch angepasstes Verfahren für unsere besondere wissenschaftliche Frage dargestellt ist, stellt das Protokoll die Blaupause eines leicht einstellbaren Systems dar, das auch ganz andere fluoreszierende Strukturen in anderen Organen und sogar in anderen Spezies ansprechen kann.
Introduction
Während der Evolution der Lichtmikroskopie erschienen viele spezialisierte Formen, die alle entwickelt wurden, um Einschränkungen im Visualisierungsprozess für bestimmte Exemplare zu minimieren. Ein solches Verfahren ist die Lichtbogen-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM). Erstmals im Jahre 1903 von Siedentopf und Zsigmondy 1 entwickelt und Anfang der 90er Jahre 2 erste biologische Grundanwendungen gefunden, ist LSFM bis heute zum leistungsstärksten mikroskopischen Werkzeug für die Visualisierung von großen Exemplaren wie intakten Mausorganen mit Fluoreszenzsignalauflösung geworden Bis auf zellulare Ebene. Aufgrund dieser Vorteile, in Kombination mit seinem Potenzial für Live-Zell-Bildgebung, Nature Methods namens LSFM die "Methode des Jahres 2014 3 ".
Wie der Name schon sagt, wird die Probenbeleuchtung in einem LSFM durch leichte Blätter durchgeführt, die senkrecht zur Achse des verwendeten Objektivs orientiert sindOder Emissionslicht-Sammlung und anschließende Bilderzeugung. Das Lichtbogen wird gewöhnlich entweder durch Fokussieren von breiten, kollimierten Laserstrahlen mit einer zylindrischen Linse oder durch die schnelle Seitwärtsbewegung von schmalen, fokussierten Laserstrahlen in nur einer horizontalen oder vertikalen Ebene 4 , 5 erzeugt . Auf diese Weise wird nur die Brennebene der Abbildungsoptik beleuchtet, typischerweise mit einer Dicke von 1-4 μm. Folglich werden für eine in der Beleuchtungsebene platzierte Fluoreszenzprobe sowohl die Erzeugung von Streulicht als auch die Effekte des Photobleichens aus Bereichen oberhalb oder unterhalb der Brennebene eliminiert oder stark unterdrückt 6 , 7 . Da alle Out-of-Focus-Flugzeuge nicht beleuchtet sind, werden in diesen Bereichen Photobleicheffekte weggelassen. Im Gegensatz zur herkömmlichen konfokalen oder Multiphotonenmikroskopie sind die Wege des beleuchteten und emittierten Lichts voneinander getrennt, so dass das endgültige Bild qual Nicht von der perfekten Fokussierung des Anregungslichtstrahls durch die Ziele abhängt. Abhängig von der zugrundeliegenden Frage ist es daher möglich, Ziele mit einem enormen Sichtfeld (FOV) zu verwenden, so dass die größtmögliche Fläche der beleuchteten Ebene ohne irgendwelche in xy-Richtung bewegenden Bauteile abgebildet werden kann.
In modernen LSFM-Systemen wird ein Fluoreszenzbild des erzeugten optischen Abschnitts auf einer hochempfindlichen ladungsgekoppelten Vorrichtung (CCD) oder komplementären Metalloxid-Halbleiter- (CMOS-) Kameras erfasst, die in der Lage sind, das gesamte Sichtfeld (FOV) zu erfassen, In Mikrosekunden. Daher ist es möglich, durch Bewegen der Probe durch das Lichtblatt und durch Erfassen von Bildern in definierten z-Schritten die vollständige 3D-Information einer Probe in einer angemessenen Zeitspanne 8 , 9 zu erhalten , wodurch diese Technik für die lebende Zelle anwendbar ist Studien 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .
Dennoch, obwohl LSFM eine schnelle, empfindliche und fluoreszenzfreundliche Methode anbietet, ist die Lichtdurchlässigkeit durch die Probe immer noch ein wichtiges Thema, besonders wenn große biologische Proben das Ziel für eine 3D-Analyse sind. Die Lichtdurchlässigkeit wird durch physikalische Aspekte der Absorption und durch Lichtstreuung an Grenzflächen von Strukturen mit unterschiedlichen Brechungsindizes kritisch modifiziert 13 . Wenn daher Proben mehrere Millimeter groß sind, wird LSFM meist mit Clearing-Protokollen kombiniert, um die Proben optisch transparent zu machen. Diese Techniken basieren auf der Idee, Wasser aus dem jeweiligen biologischen Gewebe zu entfernen und es mit wasser- oder (organischen) lösemittelbasierten Immersionsmedien auszutauschen, die so gewählt sind, dass sie die Brechungsindizes der jeweiligen Zielgewebekomponenten eng anpassen. Als Ergebnis wird die laterale Lichtstreuung minimiert und alle Wellenlängen werden minimiertVon Licht kann viel effizienter durch das Gewebe 13 gehen . In vielen Fällen erscheinen die so behandelten biologischen Proben makroskopisch kristallklar, was es ermöglicht, dass LSFM auch auf ganzen Mausorganen mit langen Arbeitsabständen mit geringem Vergrößerungsgrad durchgeführt wird.
Hier stellen wir ein Vorbereitungsprotokoll für die Großprobenabbildung in einem Lichtbogenmikroskop vor (siehe Tabelle der Materialien), das wir zur Untersuchung des zellulären Herzinfiltrums in einem Mausmodell der Myokarditis 15 etabliert haben. CD11c.DTR-Mäuse exprimieren den Primaten-Diphtherie-Toxinrezeptor (DTR) unter der Kontrolle des CD11c-Promotors 16 . Folglich werden Zellen in diesen Mäusen, die CD11c zusammen mit dem DTR exprimieren, gegenüber dem Exotoxin von Corynebacterium diphtheria (Diphtherietoxin, DTX) empfindlich gemacht ; Die systemische Behandlung dieser Tiere mit DTX führt zu einer Erschöpfung aller CD11c + ceLl CD11c ist ein Integrin und ist als Zelloberflächenrezeptor für eine Vielzahl unterschiedlicher löslicher Faktoren in Aktivierungs- und Reifungsprozessen vor allem in Zellen der monozytischen Linie 17 involviert. Folglich wurde das CD11c.DTR-Mausmodell intensiv verwendet, um die Rolle der dendritischen Zellen und Makrophagen-Teilmengen im Kontext vieler verschiedener immunologischer Fragen zu untersuchen. Im Laufe der Zeit wurde berichtet, dass CD11c.DTR-Mäuse, die systemisch mit DTX behandelt wurden, nachteilige Nebenwirkungen entwickeln und stark erhöhte Mortalitätsraten aufweisen können 18 , 19 . In letzter Zeit konnten wir die zugrunde liegende Todesursache 15 identifizieren, die die Entwicklung einer fulminanten Myokarditis nach intratrachealer DTX-Anwendung bei diesen Tieren beschreibt. Die Toxin-Herausforderung verursachte zelluläre Zerstörung, auch in zentralen Teilen des Stimulus-Übertragungssystems im Herzen. Dies wurde von massiven CD45 begleitet+ Leukozyten infiltrieren, schließlich führt zu tödlichen Herzrhythmusstörungen. In diesem Fall war nicht nur das Aussehen der Leukozytenpopulation wichtig, sondern auch ihre räumliche Verteilung im Herzen. Diese experimentelle Frage stellt eine Herausforderung für die moderne mikroskopische Bildgebung dar, die wir durch einen Lichtbogenmikroskopieansatz gelöst haben, der durch intravitale Antikörperfärbung und ein organisches Lösemittelbasiertes optisches Clearingprotokoll unterstützt wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
In der modernen Life Science spielt die mikroskopische Visualisierung biologischer Prozesse eine immer wichtigere Rolle. In diesem Zusammenhang wurden in den letzten zwei Jahrhunderten viele Entwicklungen erreicht, die helfen, Fragen zu beantworten, die bis zu diesem Punkt nicht adressierbar sind. Erstens hat es eine deutliche Tendenz gegeben, die Auflösungsfähigkeit von Lichtmikroskopen grundsätzlich zu erhöhen. Mit strukturierter Beleuchtungsmikroskopie (SIM) 21 , <sup class="xre…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung im Labor von Gunzer wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (Stipendium Nr. 0315590 n.Chr.) Und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Nr. GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) unterstützt. Wir danken dem IMCES für technische Unterstützung und Sebastian Kubat für die Hilfe bei der 3D-Karikaturmodellierung.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
Referências
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