Kvantitativ visualisering av leukocytinfiltrat i en murinmodell av Fulminant-myokardit genom ljusarkmikroskopi
Summary
Här beskrivs en mikroskopisk metod för ljusskikt för att visualisera hjärt-CD45 + leukocytinfiltratet i en murin modell av aseptisk fulminant myokardit, vilket induceras av behandling av CD11c.DTR-mus från intratracheal difteritoxin.
Abstract
Fluorescensmikroskopi (LSFM), i kombination med kemiska clearingprotokoll, har blivit guldstandard för analys av fluorescensmärkta strukturer i stora biologiska prover och ligger ner till cellulär upplösning. Under tiden möjliggör den ständiga förädlingen av underliggande protokoll och den förbättrade tillgängligheten av specialiserade kommersiella system oss att undersöka mikrostrukturen hos hela musorganen och till och med tillåta karakterisering av cellulärt beteende i olika metoder för levande cellbildningar. Här beskriver vi ett protokoll för den rumsliga helmonterade visualiseringen och kvantifieringen av CD45 + leukocytpopulationen i inflamma mushjärtan. Metoden använder en transgen musestam (CD11c.DTR) som nyligen visat sig fungera som en robust inducerbar modell för studier av utvecklingen av fulminant dödlig myokardit, kännetecknad av dödlig hjärtarytmi. Detta protokoll innefattar myokardit induktion, intravitAl antikroppsmedierad cellfärgning, organpreparation och LSFM med efterföljande datorassisterad bild efterbehandling. Även om den presenteras som en mycket anpassad metod för vår specifika vetenskapliga fråga, representerar protokollet ett lättjusterbart system som också kan rikta sig till helt olika fluorescerande strukturer i andra organ och även i andra arter.
Introduction
Under utvecklingen av ljusmikroskopi uppträdde många specialiserade former, alla utvecklade för att minimera begränsningar i visualiseringsprocessen för särskilda prover. En sådan metod är fluorescensmikroskopi med lätta blad (LSFM). Först utvecklades 1903 av Siedentopf och Zsigmondy 1 och hittade sina första grundläggande biologiska tillämpningar i början av 1990-talet 2 , har LSFM blivit det mest kraftfulla mikroskopiska verktyget hittills för visualisering av stora exemplar, såsom intakta musorgan, med en fluorescenssignalupplösning Ner till mobilnivån. På grund av dessa fördelar, i kombination med dess potential för live-cell imaging, heter Nature Methods LSFM "Årets metod 2014 3. "
Som namnet antyder utförs provbelysningen i en LSFM av lätta ark, vilka är orienterade vinkelrätt mot axeln för det använda objektet fEller utsläpps-ljusinsamling och efterföljande bildbildning. Ljusskivan genereras vanligtvis antingen genom att fokusera breda, kollimerade laserstrålar med en cylindrisk lins eller genom snabb rörelse av smala, fokuserade laserstrålar i bara ett horisontellt eller vertikalt plan 4 , 5 . På så sätt lyser endast bildbildningsoptikens fokalplan, typiskt med en tjocklek av 1-4 μm. Följaktligen elimineras eller genereras kraftigt 6,7 för ett fluorescerande prov placerat i belysningsplanet, både genereringen av spridd ljus och effekterna av fotobildning från områden ovanför eller under brännplanet. Eftersom alla out-of-focus-planer inte lyser, utelämnas fotobeläggningseffekter i dessa områden. Till skillnad från standard-konfokal- eller multi-fotonmikroskopi skiljer sig vägarna för upplyst och emitterat ljus från varandra, så den slutliga bildkvaliteten Ity beror inte på den perfekta fokuseringen av excitationsljusstrålen genom målen. Beroende på den underliggande frågan är det därför möjligt att använda målsättningar med ett enormt synfält (FOV) så att det största möjliga området av det upplysta planet kan avbildas utan att några delelement flyttar i xy-riktningen.
I moderna LSFM-system fångas en fluorescerande bild av den genererade optiska sektionen på en högkänslig laddningskopplad enhet (CCD) eller komplementära metalloxidhalvledarkameror (CMOS) som kan förvärva hela synfältet (FOV) I mikrosekunder. Genom att flytta provet genom ljusarket och genom att skaffa bilder vid definierade z-steg är det därför möjligt att erhålla full 3D-information av ett prov i en rimlig tidsperiod 8 , 9 , vilket gör denna teknik tillämplig för levande cell Studier 10 ,Röv = "xref"> 11 , 12 .
Trots att LSFM erbjuder en snabb, känslig och fluorescensvänlig metod är ljusöverföring genom provet fortfarande en viktig fråga, särskilt när stora biologiska prover är målet för en 3D-analys. Ljusöverföring modifieras kritiskt av fysiska aspekter av absorption och genom ljusspridning vid gränssnitt av strukturer med olika brytningsindex 13 . Därför kombineras LSFM när bildbehandlingsprov flera millimeter i storlek kombineras med clearingprotokoll för att göra proven optiskt transparent. Dessa tekniker är baserade på tanken att avlägsna vatten från respektive biologiska vävnad och utbyta den med vatten- eller (organiskt) lösningsmedelsbaserat nedsänkningsmedium, vilka väljs för att snävt matcha brytningsindexen för de specifika målvävnadskomponenterna. Som ett resultat minimeras lateral ljusspridning och alla våglängderAv ljus kan mycket mer effektivt passera genom vävnaden 13 . I många fall uppträder biologiska prover som behandlas på detta sätt makroskopiskt kristallklart, vilket gör att LSFM kan utföras, även på hela musorganen, med hjälp av långa arbetsavstånd, lågförstoringsmål.
Här presenterar vi ett preparatprotokoll för storprovsbildning i ett lakmikroskop (se materialtabellen), som vi har fastställt för att undersöka det cellulära hjärtinfiltratet i en murin modell av myokardit 15 . CD11c.DTR-möss uttrycker primat difteritoxinreceptorn (DTR) under kontroll av CD11c-promotorn 16 . Följaktligen görs celler i dessa möss, vilka uttrycker CD11c tillsammans med DTR, känsliga för exotoxinet av Corynebacterium difteri (difteritoxin, DTX); Den systemiska behandlingen av dessa djur med DTX resulterar i en uttömning av alla CD11c + cells. CD11c är ett integrin och är som en cell-ytreceptor för en mängd olika lösliga faktorer inblandad i aktiverings- och mognadsprocesser, huvudsakligen i celler av den monocytiska linjen 17 . Följaktligen har CD11c.DTR-musmodellen använts intensivt för att studera rollen av dendritiska celler och makrofagundergrupper i sammanhanget med många olika immunologiska frågor. Över tiden har det rapporterats att CD11c.DTR-möss som behandlas systemiskt med DTX kan utveckla negativa biverkningar och kan visa starkt förhöjda dödligheten 18 , 19 . Nyligen kunde vi identifiera den underliggande dödsorsaken 15 , som beskriver utvecklingen av fulminant myokardit efter intratracheal DTX-applikation hos dessa djur. Toxinutmaningen orsakade cellulär förstöring, inklusive i centrala delar av stimulansöverföringssystemet i hjärtat. Detta följdes av massiva CD45+ Infiltration av leukocyter, vilket slutligen leder till dödliga hjärtarytmier. I detta fall var inte bara leukocytpopulationens utseende viktigt, utan också dess rumsfördelning i hjärtat. Den här experimentella frågan är en utmaning för modern mikroskopisk bildbehandling, som vi har löst genom ett lätta arkmikroskopi-tillvägagångssätt som stöds av intravital antikroppsfärgning och ett organiskt lösningsmedelsbaserat optiskt clearingsprotokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
I modern livsvetenskap spelar den mikroskopiska visualiseringen av biologiska processer en allt viktigare roll. I detta sammanhang har många utvecklingar uppnåtts under de senaste två århundradena som hjälper till att svara på frågor som inte kan adresseras till denna punkt. För det första har det varit en tydlig tendens att fundamentalt öka upplösningsförmågan hos ljusmikroskop. Med strukturerad belysningsmikroskopi (SIM) 21 , 22 , stimulerad utsl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Gunzerlaboratoriet stöddes av tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (bidrag nr 0315590 AD) och av tyska forskningsstiftelsen (bidrag nr GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). Vi tackar vidare IMCES för teknisk support och Sebastian Kubat för hjälp med 3D-tecknade modellering.
Materials
| diphtheria toxin | Sigma Aldrich | D0564 | |
| phosphate buffered saline | Biochrom | L182-10 | |
| ketamine [50 mg/ml] | Inresa | PZN 4089014 | |
| xylazine [2 %] | Ceva | ||
| syringe | Braun | REF 9161502 | Braun Omincan F |
| indwelt venous catheter | Becton Dickinson | REF 381923 | BD Insyte Autoguard |
| small animal respirator | Harvard Apparatus | 73-0044 | MiniVent |
| anit-CD45 antibody (AF647) | BioLegend | 103124 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.2 | |
| catheter (21 G) | BD Biosciences | REF 387455 | BD valu-set |
| paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PE tube (5 ml) | Carl Roth | EKY9.1 | Rotilabo |
| ethanol | Carl Roth | 9065.4 | |
| dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| tube rotator | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | MACSmix |
| agarose (low gelling) | Sigma Aldrich | A4018 | |
| mold (15x15x5 mm) | Tissue Tek | 4566 | Cryomold |
| light sheet microscope system | LaVision Biotec | Ultramicroscope | |
| microscope body | Olympus | MVX10 | |
| objective | Olympus | 0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm | |
| sCMOS camera 5.5MP | Andor Technology | ||
| 488 nm OPSL (50mW) laser | Coherent | ||
| 647 nm diode laser (50mW) | Coherent | ||
| 3D image processing & analysis software | Bitplane | IMARIS Ver. 8.3 | |
| transgenic mouse strain | Steffen Jung et al. | CD11c.DTR | |
| wt mouse strain | Envigo | Balb/c Ola Hsd J | |
| Laser Module | LaVision Biotec | ||
| MVPLAPO 2XC Objective Lens |
References
- Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
- Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
- Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
- Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
- Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
- Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
- Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
- Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
- Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
- Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
- Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
- Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
- Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
- Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
