Sintesi di biocompatibili a cristalli liquidi in elastomero Schiume come impalcature cellulari per 3D spaziali colture cellulari

Summary

Questo studio presenta una metodologia per preparare 3D, biodegradabili, schiuma come scaffold cellulari basate su elastomeri cristalli liquidi catena laterale biocompatibili (LCEs). esperimenti di microscopia confocale mostrano che LCEs schiuma come permettere l'attacco, proliferazione, e l'allineamento spontaneo dei mioblasti C2C12s.

Abstract

Qui vi presentiamo una preparazione step-by-step di un 3D, biodegradabili, gomma-come impalcatura delle cellule. Tali ponteggi sono stati preparati mediante reticolazione blocchi a stella copolimeri dotati di unità di colesterolo come gruppi pendenti catena laterale, con conseguente smectic-A (SMA) elastomeri a cristalli liquidi (LCEs). impalcature Schiuma-like, preparati utilizzando forme in metallo, sono dotate di microcanali interconnessi, che li rende adatti come impalcature di coltura cellulare 3D. Le proprietà combinate della struttura regolare della schiuma metallo e del risultato elastomero in un'impalcatura cellule 3D che favorisce non solo superiore proliferazione cellulare rispetto alle tradizionali pellicole templated porosi, ma anche una migliore gestione del trasporto di massa (cioè, nutrienti, gas, rifiuti , ecc). La natura del modello di metallo permette una facile manipolazione del materiale espanso (cioè, rotoli o film) e per la preparazione di supporti di differenti dimensioni dei pori per diversi studi sulle cellule preservando di interfacciamentoted natura porosa del modello. Il processo di incisione non influenza la chimica degli elastomeri, conservando la loro natura biocompatibile e biodegradabile. Abbiamo dimostrato che questi LCEs smectiche, quando coltivato per lunghi periodi di tempo, permettono lo studio di clinicamente rilevanti e complessi costrutti di tessuto, favorendo la crescita e la proliferazione delle cellule.

Introduction

Esistono numerosi esempi di materiali sintetici biologici e biocompatibili destinati ad essere applicati in studi cellulari e per la rigenerazione tissutale obiettivo di adesione cellulare e la proliferazione ^{1, 2, 3, 4, 5.} Ci sono stati alcuni esempi di materiali biocompatibili, noti come elastomeri a cristalli liquidi (LCEs), che potrebbe rispondere a stimoli esterni con anisotropico molecolare ordinare ^{6, 7.} LCEs sono materiali di stimoli reattivi che combinano le proprietà meccaniche ed elastiche elastomeri con la funzionalità ottica e ordine molecolare di cristalli liquidi ^{8, 9.} LCEs possono sperimentare cambiamenti di forma, deformazione meccanica, comportamento elastico, e proprietà ottiche in risposta a STIM esterniuli (es., calore, stress, luce, ecc) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Studi precedenti hanno dimostrato che i cristalli liquidi (LC) possono percepire la crescita e l'orientamento delle cellule ^{4, 17.} È quindi possibile supporre che LCEs possono essere adatti per applicazioni biologicamente e clinicamente rilevante, compresi ponteggi cellulare e allineamento. Abbiamo già riferito la preparazione di smectiche film biocompatibili, biodegradabili, cast-stampati, e LCEs sottili con un "tipo Swiss-formaggio" morfologia porosa ^{6, 18.} Abbiamo anche preparato LCEs biocompatibili nematici con morfologia sferica come supporti per la crescita cellulare ¹⁹ <sup>, ^20. Il nostro lavoro è stato rivolto a punto delle proprietà meccaniche dei materiali da corrispondere a quelli del tessuto di interesse ^21. Inoltre, questi studi si concentrano sulla comprensione interazioni elastomero-cellula, così come risposta cellulare quando gli elastomeri sono soggetti a stimoli esterni.

Le sfide principali erano in parte per adattare la porosità dei LCEs per permettere l'attacco cellulare e permeazione attraverso la matrice elastomerica e per un migliore trasporto di massa. La porosità di questi film sottili ⁶ consentito per permeazione attraverso la massa delle cellule della matrice, ma non tutti i pori erano completamente interconnesso o aveva una dimensione più regolare (omogenea) poro. Abbiamo poi riportato su biocompatibili elastomeri nematici LCE con morfologie globulari. Questi elastomeri nematici consentiti per il fissaggio e la proliferazione delle cellule, ma la dimensione dei pori compresa soltanto 10-30 um, che ha impedito o limitato l'uso di questielastomeri con una più ampia varietà di linee cellulari ^{19, 20.}

Precedente lavoro di Kung et al. relativa alla formazione di schiume grafene utilizzando un modello metal "sacrificale" si evince che la schiuma grafene ottenuto aveva una morfologia porosa molto regolare dettata dal modello metallo scelto ^22. Questa metodologia offre il pieno controllo di porosità e dimensione dei pori. Allo stesso tempo, la malleabilità e flessibilità del modello metallo consentono la formazione di diverse forme template prima della preparazione di schiuma. Altre tecniche, come lisciviazione materiale ^23, templating gas ^24, o fibre elettro-filato ^{25, 26} offrono anche il potenziale per la preparazione di materiali porosi, ma sono più tempo e, in alcuni casi, la dimensione dei pori è limitata a solo pochi micrometri. Schiuma-come LCEs 3D preparati utilizzando forme in metallo consentono una cella di carico più elevato; un tasso di proliferazione migliorata; co-coltura; e, non ultimo, una migliore gestione del trasporto di massa (cioè, nutrienti, gas e rifiuti) per assicurare sviluppo tessuto pieno ^27. LCEs 3D gomma-come appaiono anche per migliorare l'allineamento delle cellule; questo è più probabile in relazione alle pendenti LC sensing crescita cellulare e l'orientamento delle cellule. La presenza di frazioni LC all'interno LCE sembra aumentare allineamento delle celle rispetto alla posizione della cella all'interno del scaffold LCE. Cellule allineati entro i puntoni della LCE, mentre nessun chiaro orientamento si osserva in cui i puntoni uniscono (giunzioni) ^27.

Nel complesso, la nostra piattaforma impalcatura cella LCE fungere da supporto cellulare offre la possibilità di regolare la morfologia elastomero e proprietà elastiche e di indirizzare specificamente l'allineamento (individuali) tipi cellulari per creare un ordine, disposizioni spaziali ocellule F simili ai sistemi viventi. Oltre ad un'impalcatura in grado di sostenere e dirigere la crescita cellulare a lungo termine e la proliferazione, LCEs anche consentire esperimenti dinamici, in cui l'orientamento delle cellule e interazioni possono essere modificate al volo.

Protocol

NOTA: Le seguenti operazioni per la preparazione 3D LCE gomma-come utilizzando il blocco stella 3-braccio copolimero sono mostrati in Figura 1. Per la caratterizzazione Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), gli spettri vengono registrati in cloroformio deuterato (CDCl 3) a temperatura su uno strumento Bruker DMX 400 MHz camera e internamente riferimento picchi residui a 7.26. Fourier Transform Infrared spettri (FT-IR) vengono registrati con un Bruker Vector 33 FT-IR spettrometro u…

Representative Results

Questo rapporto mostra il metodo di preparazione di un LCE 3D poroso come impalcatura per la coltura cellulare utilizzando un modello di nichel metallico. Il ottenuto 3D LCE dimostra una complessa rete di canali interconnessi che permette una facile infiltrazione di cellule, così come più adatto trasporto di massa 27. Si è constatato che le cellule sono in grado di penetrare completamente la rete di canali interconnessi e sono anche in grado di allineare all&#3…

Discussion

elastomeri liquido cristallini sono stati recentemente studiati come scaffold cellulari biocompatibili a causa della loro reattività stimoli. Essi hanno dimostrato di essere le piattaforme ideali come ponteggi cellulari. Tuttavia, un fattore importante da tenere a mente durante la preparazione e la progettazione di un nuovo scaffold LCE è la porosità. L'incorporazione di solidi lisciviabili ²³ o gas non sempre comporta porosità omogenea o pori completamente interconnessi. L'uso di un …

Materials

1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper (I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000