Síntesis de biocompatibles de cristal líquido de elastómero Espumas como andamios celulares para 3D espaciales Cultivos Celulares

Summary

Este estudio presenta una metodología para preparar 3D,, andamios celulares similares a espuma biodegradables a base de la cadena lateral elastómeros de cristal líquido biocompatibles (LCE). experimentos de microscopía confocal muestran que las LCE similares a espuma permiten para la fijación celular, la proliferación y la alineación espontánea de mioblastos C2C12s.

Abstract

A continuación, presentamos una preparación paso a paso de un 3D, andamio celular biodegradable, similar a la espuma. Estos andamios se prepararon mediante reticulación bloque en estrella co-polímeros que ofrecen unidades de colesterol como grupos colgantes de la cadena lateral, lo que resulta en esméctica-A (SMA) elastómeros de cristal líquido (LCE). andamios de tipo espuma, preparados utilizando plantillas de metal, disponen de microcanales interconectados, lo que permite adaptarse como andamios de cultivo de células 3D. Las propiedades combinadas de la estructura regular de la espuma metálica y del resultado elastómero en un andamio celular 3D que promueve la proliferación celular no sólo mayor en comparación con las películas convencionales porosos con plantilla, sino también una mejor gestión de transporte de masa (es decir, nutrientes, gases, residuos , etc.). La naturaleza de la plantilla de metal permite la fácil manipulación de formas de espuma (es decir, rollos o películas) y para la preparación de los andamios de diferentes tamaños de poro para diferentes estudios de células mientras que preserva el interconexionested naturaleza porosa de la plantilla. El proceso de grabado no afecta a la química de los elastómeros, preservando su naturaleza biocompatible y biodegradable. Se demuestra que estos LCE esmécticas, cuando se cultiva durante períodos de tiempo extensos, permiten el estudio de construcciones de tejido clínicamente relevantes y complejos mientras que la promoción del crecimiento y proliferación de las células.

Introduction

Hay varios ejemplos de materiales sintéticos biológicos y biocompatibles diseñado para su aplicación en estudios de células y para la regeneración de tejidos con el objetivo de fijación y proliferación ^{1, 2, 3, 4, 5} de la célula. Ha habido unos pocos ejemplos de materiales biocompatibles, conocidos como elastómeros de cristal líquido (LCE), que podrían responder a los estímulos externos con anisotrópico molecular ordenar ^{6, 7.} LCE son materiales estímulos-respuesta que combinan las propiedades mecánicas y elásticas de los elastómeros con la funcionalidad óptica y ordenamiento molecular de los cristales líquidos ^{8, 9.} LCE pueden experimentar cambios de forma, la deformación mecánica, comportamiento elástico, y propiedades ópticas en respuesta a stim externosuli (es decir., calor, estrés, luz, etc.) ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16.} Estudios anteriores han demostrado que los cristales líquidos (CL) pueden detectar el crecimiento y la orientación de células ^{4, 17.} Es posible entonces asumir que las LCE pueden ser adecuados para aplicaciones biológica y médicamente relevantes, incluyendo andamiaje celular y alineación. Hemos informado anteriormente de la preparación de esmécticas películas biocompatibles, biodegradables, moldeados a presión, y LCE delgadas que ofrece un "tipo de queso suizo" morfología porosa ^{6, 18.} También preparamos LCE biocompatibles nemáticos con morfología globular como andamios para el crecimiento celular ¹⁹ <sup> ^20. Nuestro trabajo se ha dirigido a la sintonía de las propiedades mecánicas de los materiales para que coincida con las del tejido de interés ^21. Además, estos estudios se centran en la comprensión de las interacciones célula-elastómero, así como la respuesta celular cuando los elastómeros están sujetos a los estímulos externos.

Los principales retos fueron en parte para adaptar la porosidad de las LCE para permitir la unión celular y permeación a través de la matriz de elastómero y para un mejor transporte de masa. La porosidad de estas películas delgadas ⁶ permitido para la permeación celular a través de la mayor parte de la matriz, pero no todos los poros eran totalmente interconectada o tenía un tamaño más regular (homogénea) poro. a continuación, se informó sobre biocompatibles elastómeros LCE nemáticos con morfologías globulares. Estos elastómeros nemáticos permitidos para la fijación y proliferación de células, pero el tamaño de poro variaron solamente a partir de 10-30 micras, lo que impidió o limitado el uso de estoselastómeros con una amplia variedad de líneas de células de ^{19, 20.}

El trabajo previo de Kung et al. relativa a la formación de espumas de grafeno utilizando una plantilla de metal "sacrificial" mostró que la espuma de grafeno obtenido tenía una morfología porosa muy regular dictada por la plantilla de metal elegido ^22. Esta metodología ofrece un control total de la porosidad y tamaño de poro. Al mismo tiempo, la maleabilidad y flexibilidad de la plantilla de metal permiten la formación de una plantilla diferente da forma antes de la preparación de espuma. Otras técnicas, tales como la lixiviación de la materia ^23, de plantillas gas ^24, o fibras electro-hilado ^{25, 26} también ofrecen el potencial para la preparación de materiales porosos, pero son más tiempo y, en algunos casos, el tamaño de poro está limitado a sólo unos pocos micrómetros. Espuma-como las LCE 3D prepararon usando plantillas de metal permiten una carga de la célula superior; una tasa de proliferación mejorada; co-cultivo; y, por último pero no menos importante, una mejor gestión de transporte de masa (es decir, los nutrientes, gases y desechos) para asegurar el desarrollo del tejido completo ^27. LCE 3D similares a espuma también parecen mejorar la alineación de celdas; esto es más probable en relación con los colgantes LC detección de crecimiento celular y la orientación de la celda. La presencia de restos de LC en el LCE parece mejorar la alineación de células con respecto a la localización de células dentro del andamio LCE. Las células se alinean dentro de los puntales de la LCE, mientras que no se observa ninguna orientación clara donde los puntales se unen (uniones) ^27.

En general, nuestra plataforma de andamio celular LCE como un medio de soporte celular ofrece oportunidades para sintonizar la morfología de elastómero y las propiedades elásticas y dirigir específicamente la alineación de los tipos de células (individuales) para crear un pedido, arreglos espaciales océlulas F similares a los sistemas vivos. Además de proporcionar un andamio capaz de sostener y dirigir el crecimiento celular a largo plazo y la proliferación, las LCE también permiten para los experimentos dinámicos, donde la orientación de células y las interacciones pueden ser modificados sobre la marcha.

Protocol

NOTA: Los siguientes pasos para la preparación de espuma como LCE 3D utilizando el copolímero de bloques en estrella 3-brazo se muestran en la Figura 1. Para la caracterización por resonancia magnética nuclear (RMN), los espectros se registran en cloroformo deuterado (CDCl3) a temperatura ambiente en un espectrómetro Bruker DMX instrumento 400-MHz e internamente referencia picos residuales a 7,26. Transformada de Fourier de infrarrojos espectros (FT-IR) se registran usando …

Representative Results

Este informe muestra el método de preparación de un LCE 3D poroso como un andamio para el cultivo celular utilizando una plantilla de metal de níquel. El LCE 3D obtenida demuestra una compleja red interconectada de canal que permite la infiltración de células fácil, así como el transporte de masa más adecuado 27. Se encontró que las células son capaces de penetrar completamente la red de canales interconectados y también son capaces de alinear dentro de…

Discussion

elastómeros cristalinas líquidas han sido recientemente estudiado como andamios celulares biocompatibles debido a su capacidad de respuesta estímulos. Ellos han demostrado ser plataformas ideales como andamios celulares. Sin embargo, un factor importante a tener en cuenta en la preparación y el diseño de un nuevo andamiaje LCE es la porosidad. La incorporación de los sólidos lixiviables ²³ o gases no siempre resulta en la porosidad homogénea o poros totalmente interconectados. El uso de u…

Materials

1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper (I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000