Den innåndingsenhet som er beskrevet her kan generere, prøve for karakterisering, og jevnt å avsette et medikament aerosol i lungene hos gnagere. Dette gjør det mulig for pre-klinisk bestemmelse av effektiviteten og sikkerheten av legemiddeldoser avsatt i lungene; nøkkeldata slik at klinisk inhalert legemiddelutvikling.
Obstruktive luftveissykdommer som astma og kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) blir for tiden behandlet ved inhalasjon anti-inflammatorisk og bronkodilaterende medikamenter. Til tross for tilgjengeligheten av flere behandlinger, er begge sykdommene økende folkehelse bekymringer. Flertallet av astma pasienter er godt kontrollert på aktuelle inhalerte behandlinger, men et betydelig antall pasienter med alvorlig astma er det ikke. Astma påvirker anslagsvis 300 millioner mennesker over hele verden, og ca 20 prosent har en alvorlig form av sykdommen. I motsetning til astma, er det få effektive behandlingsformer for KOLS. Anslagsvis 10% av befolkningen har COPD og trenden i dødsrater er økende for KOLS samtidig redusere til andre alvorlige sykdommer. Selv om utvikling av legemidler for levering til inhalasjon er utfordrende, gjør det mulig for nese-inhalering eneste enhet direkte levering av nye medikamenter til lungene av gnagere for effekt og sikkerhet / Toksikologistudier prekliniske. Inhalert legemiddelavleveringhar flere fordeler for luftveissykdommer, hvor høy konsentrasjon i lungene bedrer effektiviteten og minimaliserer systemiske bivirkninger. Inhalasjonssteroider og bronchodilators dra nytte av disse fordelene og inhalert levering kan også holde potensialet for fremtidige biologisk behandling. Den innåndingsenhet som er beskrevet her kan generere, prøve for karakterisering, og jevnt å avsette et medikament aerosol i lungene hos gnagere. Dette gjør det mulig for pre-klinisk bestemmelse av effektiviteten og sikkerheten av legemiddeldoser avsatt i lungene til gnagere, nøkkeldata nødvendig før igangsetting klinisk utvikling.
Det er mange fordeler med inhalert administrering av legemidler for behandling av luftveissykdom. Inhalert levering gjelder det terapeutiske middel direkte til virkningsstedet, lungene. En høy lokal konsentrasjon av medikamentet i lungene gir en betydelig fordel som minimerer dose og systemisk eksponering, og maksimerer effekten. Dette er en viktig fordel som i stor grad kan øke den terapeutiske indeksen (TI, forholdet mellom dosen av legemiddel som forårsaker en side-effekt over den dose av stoffet som gir effekt) av et medikament. Inhalerte β 2-adrenerge agonister, kortikosteroider og anti-cholinergiske medikamenter har vist seg effektive ved forbedring av lungefunksjonen hos pasienter med astma og KOLS, samtidig minimere de systemiske bivirkninger (takykardi, immunsuppresjon, og forstoppelse) observert når disse stoffene blir tatt oralt. Nye legemiddelgrupper (for eksempel PDE4-inhibitorer 1 og BTK hemmere 2) har nyligvist seg effektiv ved forbedring av lungefunksjonen i pre-kliniske dyresykdomsmodeller, men i likhet med P2-agonister, kortikosteroider og anti-kolinerge midler, lider av systemiske bivirkninger som kan minimaliseres ved inhalasjon levering. På grunn av den økte kostnaden for utvikling av inhalerte vs. orale medikamenter, bør en inhalert formulering kun anses for respiratoriske indikasjoner etter vellykket oral / systemisk administrering viser dosebegrensende mekanisme-baserte systemiske bivirkninger.
Pre-klinisk, inhaleres forbindelser optimalisert for å øke den TI, som krever in vivo-effektivitet og side-effektmålinger. Opprinnelige disse målinger kan gjøres i separate analyser, vanligvis en topisk leverte effekt til måling og en systemisk levert bivirkning måling, men for å sammenligne virkelig forbindelser, bør effekt og bivirkninger måles i de samme dyr etter inhalasjon. Dette krever dose / responsstudier at achieve nok til forbindelsen som blir administrert til lungene for å indusere en målbar bivirkning. Den eneste måten for tiden for jevnt å fordele store doser av medikament i lungene til flere små dyr samtidig er nese-inhalering bare 3, 4, 5. Styrker og svakheter ved ulike innånding eksponeringsteknikker har nylig blitt anmeldt 6, 7, 8. Spesialisert utstyr og en stor mengde av testforbindelse (gram mengder) er nødvendig for nese-bare inhalert legemiddelavlevering, men proof-of-concept studier kan være mulig på annen måte.
Når mengden av medikament som er begrenset (mg mengder), direkte administreringsmetodene er et alternativ, men alle lider av ikke-homogen avsetning, med mer medikament konsentrert langs den sentrale luftveier og mindre godt representert i parenchymal / alveolarområder 3, 4, 5. Den effektive dose som ble avlevert ved direkte drypping er alltid høyere, og kan ikke sammenlignes direkte med inhalerte doser 4. Direkte instillasjon metoder inkludert intranasal 9, intratrakeal væske 10, 11 og sprøyte instillasjon 12, eller tørr-pulver insufflasjon 13, kan 14 benyttes som et screening-verktøy for å bestemme den omtrentlige doseområde for senere nese-bare inhalasjonsundersøkelser, eller for å bestemme vurdering av effekt / toksisitet for en rekke strukturelt lignende stoffer 15. På grunn av den sentrale luftveiene avsetningsmønsteret kan direkte administreringsmetodene være mer nyttig å bestemme effektene av forbindelser som virker på de sentrale luftveier (bronkodilatorer eller mastcelle-inhibitorer) enn in den perifere lunge (antiinflammatoriske midler).
I motsetning til mennesker, som kan inhalere en betydelig dose av konsentrert aerosol fra en inhalator i en enkelt dypt åndedrag, kontinuerlig generering av en respirerbar (0,5-5 um massemedianaerodynamisk diameter, MMAD) aerosol, i opp til en time, kreves for å avsette en virksom medikamentdose inn i et spontant pustende gnagere lunger i en nese-inhalering bare systemet 16. Aerosol-generatorer (jetforstøver eller Wright Dust Feed-17) som kontinuerlig kan produsere den nødvendige aerosolen partikkelstørrelse og konsentrasjon for nese-bare inhalasjonsundersøkelser ikke er svært effektiv til å generere høy kvalitet (respirerbare) aerosoler. Den medikamenttilførselshastigheter for disse aerosolgeneratorer for kraftig (IC50 pM til nM i funksjonelle cellebaserte analyser) forbindelser er vanligvis i området 1 til 10 mg / min område og vanligvis mindre enn 1% av det legemiddelaero gjør det til pustesonen av dyrene(Figur 1). Mange av partiklene som genereres er for store (> 5 um) for å gå inn i lungene og blir fjernet ved hjelp av en aerosol-deler (en pre-separator eller med en syklon 5 um snitt punkt) for å unngå en stor dose av medikament i nesen. Å legge til ineffektiviteten av nese-bare inhalasjonssystemer er den lille partikkelstørrelsesområde (0,5 til 5 um MMAD) av respirerbare partikler. Mange av aerosolpartiklene mindre enn 0,5 um utåndet (som sigarettrøyk) og ikke avsettes i lungene 18. Også mange av de "større" aerosol partikler (~ 5 mikrometer) innskudd i nesen blir absorbert eller transporteres ved mukociliær klaring mot baksiden av halsen hvor de er svelget ned i magen 19. Ved bruk av nese-bare inhalasjon er dosen avsatt i nesen er alltid større enn dosen som er avsatt i lungene og nese dosen kan bidra til systemisk eksponering og bivirkninger 20. Naturlig, innånding Drug doser er liten (i mikrogram-området) minimaliserer systemisk bivirkning potensialet av medikament som absorberes av nasal, lunge-, gastrointestinal eller vev. Selv når partikkelstørrelsen i den aerosol som leveres til dyrene er i det respirerbare området, et gjennomsnitt på bare 4% av aerosolpartiklene som gjør det til pustesonen til det dyr som avsettes i lungene. Mer effektive aerosolgeneratorer er tilgjengelige, men de jetforstøver og Wright Dust Feed-er enestående for deres evne til å produsere kontinuerlige aerosoler fra forskjellige flytende og tørre pulverformuleringer, henholdsvis.
Respirerbar aerosol fra det pre-separatoren føres inn i nesen-eneste eksponering innåndingsenhet 21 som er basert på en strømnings forbi nesen utformingen 22. Den innåndingsenhet har 3 lagene (bare to lag er vist på figur 1), og hvert lag består av 10 eksponerings porter for dyr og aerosol prøvetaking. Portene er plassert periferisk rundt central aerosol plenum. Bevisste mus blir plassert i glassholderne (6 inches lange med 1,2 tommer i diameter) og puste aeros innholdet i innåndingsenhet. Musene ikke akklimatisert til holdeinnretninger 23. Tidligere erfaring har vist at mus tåler rør beherskelse av mindre enn en time varighet på lignende måte, med eller uten tilpasning 2.
Den innåndingsenhet er konstruert for å levere medikament aerosoler direkte til lungene av dyrene samtidig unngå eksponering til operatørene. Styrken / toksisitet av disse stoffene er vanligvis ukjente og flere ingeniørsikkerhetskontrollene er brukt for å unngå eksponering for operatørene. Operatørene må alltid bruke personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakker, respiratorer, og vernebriller). Den ytre plenum av innåndingsenhet er under negativt trykk til enhver tid under drift, slik at for fjerning av enkelt eller grupper av dyr uten huUT stenge av aerosolgeneratoren. Den innåndingsenhet er også inneholdt i en sekundær kabinett som holdes ved et negativt trykk ved hjelp av en utløpsåpning i taket for å forhindre utslipp av aerosol inn i rommet i tilfelle av funksjonssvikt. All utstrømning av luft fra inhaleringssystem blir filtrert av et HEPA-filter før utslipp til omgivelsene. Nesen kun eksponering systemet som brukes i dette manuskriptet ble kjøpt fra en enkelt leverandør (se supplerende Table of Materials).
En nese-inhalering bare anlegg og drift, for å levere farmasøytiske aerosoler til lungene hos gnagere er blitt beskrevet. Begrensende dyr i nese-bare holdere er en vanlig brukt metode for å utsette dyrene for luftbåret materiale. Et eksperiment ble utført for å demonstrere den antikolinerge bronkodilator ipratropiumbromid 34 kan potent reversere metacholin-indusert bronkokonstriksjon ved levering av nese-inhalering bare til mus med en ED50 på 0,1 pg / kg avsatte dose. En større enn 10 gangers økning i effektiv dose av ipratropium var nødvendig for bronkodilatasjon følgende intratrakeal levering (ED 50 intratrakeal = 1,3 ug / kg, data ikke vist) levering. Dette er på grunn av ikke-homogen avsetting mønster av medikament i lungene som produseres ved intratrakeal doserings 3, 5, 10. 10 ganger og mer effektiv doseforskjeller mellom inhalerte og intratrakeale doserings teknikker for andre narkotiske stoffer er blitt observert tidligere av andre 4.
Den ikke-homogene avsetningsmønsteret av medikament i lungene som produseres ved intratrakeal dosering bremser også absorpsjonen av lungen 35, redusere den hastighet ved hvilken medikamentet går inn i den systemiske sirkulasjon og redusere sjansene for å se systemiske bivirkninger. Derfor, for å optimalisere sikkerhet / effektivitet (terapeutisk indeks) 36 av nye inhalerte medikamenter, bør nese-inhalering bare levering benyttes. Intratracheal avsetning vil gi en unøyaktig estimat av TI ved å generere feilaktig høye effektive doser i lungen og lave doser til den systemiske sirkulasjon.
Som leveres av inhalasjon nye legemidler er utviklet, er det viktig å riktig sette effektive medikamentdosen fra prekliniske effektstudiene for å forutsi en efficacious human dose for kliniske studier. Den beryktede død Tusko elefanten 37 er ofte sitert i litteraturen for å minne oss å bruke allometrisk skalering å forutsi interlegemiddeldoser og at interlegemiddeldoser bør ikke lineært ekstrapolert på grunnlag av en enkel sammenligning av kroppens massene. Det er vanlig å bruke en allometriske tilnærming med en allometriske eksponent b fra 0,67 til å forutsi human medikamentdoser fra preklinisk effektivitetsstudier 38. Ved å bruke musen inhalert ED90 på 0,9 ug / kg for ipratropium, en allometriske eksponent på 0,67, en mus kroppsvekt på 0,03 kg, og en menneskekropp masse på 60 kg; anslagsvis humant ED 90 på 0,07 mikrogram / kg ((0,9 * (0,03 / 60) (1-0,67) = 0,07) kan bli beregnet som den antatte humane avsatte dose fra våre mus data. Denne forutsagte verdi er sammenlignbar med den faktiske humane virksom avsatte dose på 0,26 ug / kg, som kan beregnes fra den leverte gjørese av 40 ug 39 dividert med det menneskelige legeme masse på 60 kg multiplisert med en human oral inhalering lungeavsetning fraksjon 16 fra 0,4 ((40/60) * 0,4 = 0,26). Et estimat av det effektive humane inhalert avsatte dose bidrar også til å planlegge de leverte doser som er brukt i inhalering toksisitetsstudier som er nødvendig for kliniske forsøk 40.
Den spesialutstyr og store mengder av testforbindelse (gram-mengder) som kreves for nese-bare inhalert legemiddelavlevering kan være betydelige begrensninger ved utviklingen av nese-inhalering eneste teknikk. En kalibrerings løpe uten dyr som er tilstede er nødvendig hvis en spesifikk dose er nødvendig for en (vanligvis toksikologi og ikke en effekt dose / respons) studien, og denne kalibrerings løp vil kreve ytterligere legemiddel for å være tilgjengelig. Denne kalibreringen løp er nødvendig fordi de fysikalsk-kjemiske egenskaper av hvert legemiddel / preparat kan variere nok til i stor grad påvirke den avsatte doseav medikament i lungene. Optimalisering av luft og medikament-tilførselshastigheter til aerosolgeneratoren under kalibrerings løp er nødvendig for å oppnå en aerosol partikkelstørrelse og konsentrasjon for den spesifikke dose som er nødvendig. Mens aerosolgeneratoren luft og medikament-tilførselshastigheter foreslått i fremgangsmåtene er et rimelig utgangspunkt, er det potensial som for en spesifikk medikamentformulering en ikke-respirerbar (partikkelstørrelse> 5 mm) aerosol vil bli generert. På preklinisk stadium, er det ofte ikke nok stoff tilgjengelig for å gjøre en kalibrering drevet, og det er umulig å vite a priori hvilke doser (hvis noen) får inn i lungene. Dessuten er statisk elektrisitet produsert i løpet av den aerosol-genereringsprosessen, og kan påvirke den tid som kreves for aerosolkonsentrasjonen å komme i likevekt. Det er viktig å riktig jorde utstyr for å minimere statisk elektrisitet. Et annet alternativ for å redusere statisk elektrisitet, er å legge til fuktighet til luften som tilføres innåndingsenhet, for å øke ledningsevnen ogavlede elektrostatiske ladninger på partiklene 25. Fukting av luften som leveres til aerosolgeneratoren er ikke nødvendig for dyr komfort under kort (<1 h) doseringssesjoner men bør overveies dersom lengre doseringstider anvendes.
Medikamenter kan tilføres til lungene av dyrene ved passiv nese-inhalering eller bare direkte intratrakeale administreringsmetodene som omgår nasofaryngealt deponering. Nese-inhalering bare levering er vanligvis brukes på området for innånding toksikologi 41, men er sparsomt anvendt tidlig i drug discovery prosessen. Et tverrfaglig forskerteam er nødvendig for å gjennomføre nese-bare inhalasjonsstudier på grunn av: behovet for store mengder av stoffet, spesialisert kunnskap som kreves for å formulere, generere og karakter aerosoler; operere komplisert utstyr, og måling av legemidlets effekt i dyremodeller av luftveissykdom. Leverings teknikker som er beskrevet her, blir brukt til å utvikle small molekyl inhalerte medikamenter, men i fremtiden kan anvendes for å utvikle inhalerte biologiske 42, 43. Forhåpentligvis de prosedyrer og tips dokumentert i dette manuskriptet vil lette nye pre-kliniske drug discovery og toksikologi forskere til å erverve den kompetansen som trengs for å levere narkotika til gnagere av aerosol innånding.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkjenner: Dr. Thomas Budiman på TSE Systems GmbH for sin tekniske kompetanse og utstyr tilpasning. John Fry (Battelle Inc.) og Dr. Rudy Jaeger (CH Technologies Inc.) for sine nyttige diskusjoner. Tian Wu, Sam Mboggo april Miller, og Sean Davis (Amgen) for å få hjelp med forsøkene.
Nose-only exposure inhalation unit | TSE systems | 700100-KNES-040-ss | Custom configurations available |
DACO data acquisition system | TSE systems | 700400-PRO-C-D/1 | |
MC One Jet Mill | Jetpharma | DEC MicroJet 10 | |
Turbula Mixer | GlenMills Inc | T2F | |
Micronized Lactose | DFE Pharma | Lactohale 200 | |
Hydraulic press | Specac | GS15011 | |
Cascade impactor filters | Pall Life Sciences | 7219 | Emfab filter |
Absolute filters | Whatman | 10370302 | 5 cm diameter |
Real time aerosol monitor Microdust Pro Monitor |
Casella | CEL-712 | |
Ipratropium bromide | Spectrum Chemical | I1178 | pre-micronized |
flexiVent FX1 system | scireq | FV-FXCS |