تحليل الآلي تقلص الإنسان المهندسة القلب الأنسجة للفحص القلب سلامة الأدوية
Summary
هنا، نقدم لك مجموعة من جيل البشرية هندسة أنسجة القلب من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة الإمكانات (hiPSC) -derived العضلية. نقدم طريقة لتحليل قوة التقلص وتغيير المثالي لنمط تقلص من قناة- herg قناة المانع E-4031. يظهر هذا الأسلوب مستوى عال من المتانة وصلاحيتها للفحص المخدرات القلب.
Abstract
يصف هندسة الأنسجة القلبية التقنيات لتشكل ثلاثة الأنسجة المهندسة الأبعاد توليد القوة. لتنفيذ هذه الإجراءات في البحوث الأساسية وتطوير العقاقير قبل السريرية، فمن المهم وضع بروتوكولات لتوليد وتحليل الآلي في ظل ظروف موحدة. هنا، نقدم تقنية لتوليد أنسجة القلب مهندسة (EHT) من العضلية من مختلف الأنواع (الجرذان والفئران والبشرية). وتعتمد هذه التقنية على التجميع من الليفين هلام يحتوي على العضلية فصل بين polydimethylsiloxane مرن (PDMS) المشاركات في شكل 24-جيدا. يشكل ثلاثي الأبعاد، EHTs توليد قوة في غضون أسبوعين بعد الصب. يسمح هذا الإجراء لتوليد عدة مئات من EHTs في الأسبوع، ويقتصر من الناحية الفنية إلا من خلال توافر العضلية (0،4-1،0 × 10 6 / EHT). يتم تقييم تقلصات العضلات متقلص ضد تزايد المقاومة في غرفة الحضانة تعديل مع ميكانالتعشيق كال ل24 لوحات جيدا وكاميرا وضعت على رأس هذه القاعة. يتحكم البرمجيات انتقلت الكاميرا على نظام محور XYZ لكل EHT. تم الكشف عن تقلصات EHT بواسطة خوارزمية التعرف على الرقم الآلي، ويتم احتساب القوة على أساس تقصير من EHT والميل مرونة والهندسة وظائف PDMS. يسمح هذا الإجراء للتحليل الآلي للارتفاع أعداد EHT في ظل ظروف موحدة ومعقمة. كشف موثوق بها من آثار المخدرات على انكماش cardiomyocyte هو أمر حاسم لتطوير الأدوية القلبية والصيدلة السلامة. علينا أن نبرهن، مع مثال على قناة- herg قناة المانع E-4031، أن النظام EHT البشري يتطابق الردود المخدرات على حركية انقباض القلب البشري، مشيرا إلى أن يكون أداة واعدة لفحص القلب سلامة الدواء.
Introduction
وقد أدت الآثار الجانبية القلبية مثل متلازمة QT الطويلة التي يسببها الدواء لسحب السوق خلال السنوات الماضية. وتشير الإحصاءات إلى أن حوالي 45٪ من جميع عمليات السحب ومن المقرر أن الآثار غير المرغوب فيها على نظام القلب والأوعية الدموية 1. هذا الفشل المخدرات بعد العملية التنموية مكلفة والموافقة هو السيناريو الأسوأ لشركات الأدوية. لذا تركز إدارات البحوث والتطوير في مجال الكشف عن هذه الآثار غير المرغوب فيها القلب والأوعية الدموية في وقت مبكر. لالمخاوف الاقتصادية والأخلاقية، والجهود المبذولة للحد من التجارب على الحيوانات واستبدالها فحوصات في المختبر فحص جديدة جارية.
وأدرجت مجموعة من المقايسات التي أنشئت في إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) والوكالة الأوروبية للأدوية (EMA) مبادئ توجيهية لتقييم ما قبل السريرية من آثار المخدرات proarrhythmic 2. تكنولوجيا إعادة برمجة الخلايا الجسدية تليها تمايزالناجمة عن النشاط البشري الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) عززت هذا المجال البحثي 3. الآن يوفر إمكانية لفرز المرشحين دواء جديد على العضلية البشرية في المختبر، ويتجنب القضايا مع وجود اختلافات بين الأنواع. الأخيرة البروتوكولات تمايز القلب 4، 5 توفر امدادات غير محدودة من العضلية دون القلق الأخلاقي. ومع ذلك، فإن قياس قوة مقلص، وأهم وأفضل وصف في المعلمة الجسم الحي الخلايا العضلية، لم يتم تأسيس جيدا. ويرتبط هذا إلى عدم النضج النسبي 6 من الجذعية المحفزة العضلية المشتقة من الخلايا البشرية التي يسببها (hiPSC-CM) بالمقارنة مع cardiomyocyte الكبار. وتقدم محتمل هو مهندس أنسجة القلب 3-الأبعاد من الخلايا واحد 7 (هندسة أنسجة القلب، EHT). ويستند البروتوكول EHT على تضمين الفئران واحد أو العضلية الإنسان 8 </سوب>، 9، 10 في هيدروجيل الليفين بين اثنين polydimethylsiloxane مرن (PDMS) المشاركات 11 في شكل 24-جيدا. في غضون بضعة أيام تبدأ العضلية للتعاقد بشكل عفوي كما الخلايا واحد والبدء في تشكيل الشبكات الخلوية. بعد 7-10 أيام، تقلصات العيانية من الأنسجة كلها مرئية. وخلال هذه العملية يتم تشكيلها المصفوفة خارج الخلية، مما يؤدي إلى انخفاض قطرها وطولها. تقصير نتائج EHT في الانحناء للPDMS نشر حتى أثناء الراحة، إخضاع العضلية في EHT النامية لتحميل المستمر. تستمر EHTs لأداء تقلصات العضلات متقلص ضد تزايد المقاومة على مدى عدة أسابيع. تظهر EHTs البشري الردود على التحفيز الفسيولوجية والدوائية مبينا مدى ملاءمتها لفحص المخدرات والمرض النمذجة 7.
في هذه المخطوطة نقدم بروتوكول قوية وسهلة للالجيلعلى من EHT الإنسان، وتحليل انقباض الآلي للتغيرات التي تعتمد تركيز نمط انكماش في وجود مثبطات قناة قناة- herg.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم المهندسة أنسجة القلب خيار قيمة إلى مربع أداة للبحوث القلب والأوعية الدموية. وقد أثبتت EHTs في شكل 24-جيدا قيمة لنمذجة مرض 8، 14، وفحص سلامة الدواء 7، 8، 10، 11، <s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ممتنون لأليساندرا موريتي ودينيس شايد للمساهمة عينية من المواد. ونحن نعترف الدعم الكبير من الفريق العامل الجذع وEHT في وزارة التجريبية الأدوية والسموم من UKE. ويدعم هذا العمل من المؤلفين من المنح المقدمة من DZHK (المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية) والوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث (BMBF)، مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG إس 88 / 01/12، HA 3423 / 5-1 )، المركز الوطني البريطاني لاستبدال صقل والحد من الحيوانات في البحوث (NC3Rs CRACK-IT تمنح 35911-259146)، ومؤسسة القلب البريطانية RM / 13/30157، والمجلس الأوروبي للبحوث (متقدم غرانت IndivuHeart)، ومؤسسة القلب الألمانية وفراي اوند Hansestadt هامبورغ.
Materials
| EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
| EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-well-plate | Nunc | 144530 | |
| 6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| 15 ml falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
| Spinner flask | Integra | 182 101 | |
| Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
| T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
| V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
| 10× DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
| Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
| Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
| Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
| iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U – HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
Referências
- Laverty, H. How can we improve our understanding of cardiovascular safety liabilities to develop safer medicines?. Br J Pharmacol. 163 (4), 675-693 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Burridge, P. W. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Kempf, H., Kropp, C., Olmer, R., Martin, U., Zweigerdt, R. Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture. Nat Protoc. 10 (9), 1345-1361 (2015).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circ Res. 114 (3), 511-523 (2014).
- Mannhardt, I. Human Engineered Heart Tissue: Analysis of Contractile Force. Stem Cell Reports. 7 (1), 29-42 (2016).
- Eder, A. Effects of proarrhythmic drugs on relaxation time and beating pattern in rat engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 109 (6), 436 (2014).
- Stöhr, A. Contractile abnormalities and altered drug response in engineered heart tissue from Mybpc3-targeted knock-in mice. J Mol Cell Cardiol. 63, 189-198 (2013).
- Schaaf, S. Human Engineered Heart Tissue as a Versatile Tool in Basic Research and Preclinical Toxicology. PLoS One. 6 (10), e26397 (2011).
- Hansen, A. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ Res. 107 (1), 35-44 (2010).
- Frank, S., Zhang, M., Schöler, H. R., Greber, B. Small molecule-assisted, line-independent maintenance of human pluripotent stem cells in defined conditions. PloS One. 7 (7), e41958 (2012).
- Lanier, M. Wnt inhibition correlates with human embryonic stem cell cardiomyogenesis: A structure-activity relationship study based on inhibitors for the Wnt response. J Med Chem. 55 (2), 697-708 (2012).
- Hirt, M. N. Increased afterload induces pathological cardiac hypertrophy: a new in vitro model. Bas Res Cardiol. 107 (6), 307-323 (2012).
- Jacob, F. Analysis of Tyrosine Kinase Inhibitor-Mediated Decline in Contractile Force in Rat Engineered Heart Tissue. PLoS One. 11 (2), e0145937 (2016).
- Friedrich, F. W. Evidence for FHL1 as a novel disease gene for isolated hypertrophic cardiomyopathy. Hum Mol Genet. 21 (14), 3237-3254 (2012).
- Crocini, C. Impact of ANKRD1 mutations associated with hypertrophic cardiomyopathy on contraction parameters of engineered heart tissue. Bas Res Cardiol. 108 (3), 349 (2013).
- Fiedler, J. Development of Long Noncoding RNA-Based Strategies to Modulate Tissue Vascularization. J Am Coll Cardiol. 66 (18), 2005-2015 (2015).
- van Meer, B. J. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophysl Res Commun. , (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G. Physiologic force-frequency response in engineered heart muscle by electromechanical stimulation. Biomaterials. 60, 82-91 (2015).
- Eng, G. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nat Commun. 7, 10312 (2016).
- Huebsch, N. Miniaturized iPS-Cell-Derived Cardiac Muscles for Physiologically Relevant Drug Response Analyses. Sci Rep. 6 (24726), 1-12 (2016).
- Masumoto, H. The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages. Sci Rep. 6 (29933), 1-10 (2016).
- Ravenscroft, S. M., Pointon, A., Williams, A. W., Cross, M. J., Sidaway, J. E. Cardiac Non-myocyte Cells Show Enhanced Pharmacological Function Suggestive of Contractile Maturity in Stem Cell Derived Cardiomyocyte Microtissues. Toxicol Sci. 152 (1), 99-112 (2016).
- Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenbutg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Vandenburgh, H. Durg-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle. Muscle Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).
