Automatisé Contraction L'analyse des tissus humains Engineered cardiaque pour le dépistage de la sécurité cardiaque médicaments
Summary
Ici, nous montrons la génération de tissu cardiaque humain conçu à partir de cellules souches pluripotentes induites (hiPSC) cardiomyocytes dérivée de. Nous présentons une méthode pour analyser la force de contraction et de modification à titre d'exemple de configuration de contraction de l'inhibiteur du canal hERG E-4031. Cette méthode montre haut niveau de robustesse et l'aptitude pour le dépistage des drogues cardiaque.
Abstract
ingénierie de tissu cardiaque décrit des techniques pour constituer trois forces génératrices de dimensions tissus d'ingénierie. Pour la mise en œuvre de ces procédures dans la recherche fondamentale et le développement préclinique de médicaments, il est important de développer des protocoles pour la production et l'analyse automatisée dans des conditions normalisées. Nous présentons ici une technique pour générer du tissu cardiaque Engineered (EHT) de cardiomyocytes de différentes espèces (rat, souris, humaines). La technique repose sur l'assemblage d'un gel de fibrine contenant des cardiomyocytes dissociées entre les postes polydiméthylsiloxane élastique (PDMS) dans un format à 24 puits. En trois dimensions, HASTI produisant une force constituent dans les deux semaines après la coulée. Cette procédure permet la génération de plusieurs centaines de HASTI par semaine et est techniquement limitée que par la disponibilité des cardiomyocytes (0,4-1,0 x 10 6 / EHT). Evaluation des contractions musculaires auxotonique est effectuée dans une chambre d'incubation modifié avec un mécaninterlock ical pour plaques à 24 puits et une caméra placée au-dessus de cette enceinte. Un logiciel commande une caméra déplacée sur un système d'axes XYZ de chaque EHT. contractions EHT sont détectées par un algorithme de reconnaissance automatique de la figure, et la force est calculée sur la base de raccourcissement de la EHT et la propension élastique et la géométrie des postes de PDMS. Cette procédure permet une analyse automatisée des nombres élevés de EHT dans des conditions normalisées et stériles. La détection fiable des effets des médicaments sur la contraction des cardiomyocytes est crucial pour le développement de médicaments et la pharmacologie cardiaque de sécurité. Nous démontrons, avec l'exemple du système E-4031, que le EHT humain inhibiteur du canal hERG reproduit les réponses des médicaments sur la cinétique de contraction du cœur humain, ce qui indique qu'il est un outil prometteur pour le dépistage cardiaque de l'innocuité des médicaments.
Introduction
effets secondaires cardiaques tels que le syndrome du QT long induite par le médicament ont conduit à des retraits du marché au cours des dernières années. Les statistiques indiquent qu'environ 45% de tous les prélèvements sont dus à des effets indésirables sur le système cardio – vasculaire 1. Cette défaillance du médicament après le processus de développement coûteux et l'approbation est le pire scénario pour les entreprises pharmaceutiques. services de recherche et de développement se concentrent donc sur la détection de ces effets cardiovasculaires indésirables tôt. Pour des questions économiques et éthiques, les efforts visant à réduire l' expérimentation animale et les remplacer par de nouveaux tests de dépistage in vitro sont en cours.
Un ensemble de tests établis sont inclus dans les lignes directrices et des aliments aux États-Unis Drug Administration (FDA) et l' Agence européenne des médicaments (EMA) pour l' évaluation préclinique des effets des médicaments proarythmiques 2. La technologie de cellules somatiques suivi reprogrammation par la différenciation desLes cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) stimulé ce champ de recherche 3. Il offre maintenant la possibilité de dépister de nouveaux médicaments candidats sur cardiomyocytes humains in vitro et évite les problèmes avec des différences entre espèces. Protocoles de différenciation cardiaques récents 4, 5 fournissent l' offre illimitée de cardiomyocytes sans souci éthique. Cependant, la mesure de la force contractile, le plus important et le mieux caractérisé pt ce paramètre vivo de cardiomyocytes, est pas bien établie. Ceci est lié à la relative immaturité 6 des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC-CM) par rapport à la cardiomyocytes adulte. Un progrès possible est de concevoir trois dimensions du tissu cardiaque à partir de cellules individuelles 7 (ingénierie tissulaire cardiaque, EHT). Le protocole EHT est basée sur l' incorporation des cardiomyocytes humains ou murins unique 8 </sup>, 9, 10 en hydrogel de fibrine entre deux postes polydiméthylsiloxane flexible (PDMS) 11 en format 24 puits. En quelques jours, les cardiomyocytes commencent à se contracter spontanément comme des cellules individuelles et commencent à former des réseaux cellulaires. Après 7-10 jours, les contractions macroscopiques du tissu entier sont visibles. Au cours de ce processus est remodelé la matrice extracellulaire, ce qui conduit à une diminution du diamètre et de la longueur. Le raccourcissement des résultats EHT en flexion des PDMS même post pendant le repos, la soumission cardiomyocytes dans le développement EHT à la charge continue. HASTI continuent d'effectuer des contractions musculaires auxotonique pendant plusieurs semaines. HASTI humains montrent des réponses à la stimulation physiologique et pharmacologique indiquant leur aptitude à modéliser le dépistage des drogues et de la maladie 7.
Dans ce manuscrit, nous présentons un protocole robuste et facile pour les generatisur de EHT humain, et l'analyse de la contractilité automatisée des changements dépendant de la concentration du motif de contraction en présence d'inhibiteurs du canal hERG.
Protocol
Representative Results
Discussion
tissu cardiaque conçu offre une option valable à la boîte à outils de la recherche cardiovasculaire. HASTI dans le format de 24 puits se sont révélés utiles pour la modélisation de la maladie 8, 14, le dépistage de l' innocuité des médicaments 7, 8, 10, 11, 15, ou la recherche cardiovas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Alessandra Moretti et Dennis Schade pour leur contribution type de matériel. Nous reconnaissons le grand soutien du groupe de travail iPS et EHT au Département de pharmacologie et de toxicologie expérimentale de l'UKE. Le travail des auteurs est pris en charge par des subventions du DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire) et le ministère allemand de l'éducation et de la recherche (BMBF), la Fondation allemande pour la recherche (DFG Es 88 / 12-1, HA 3423 / 5-1 ), Centre national britannique pour le remplacement Raffinement et réduction des animaux en recherche (NC3Rs CRACK-IT accorde 35911-259146), la British Heart Foundation RM / 13/30157, le Conseil européen de la recherche (Advanced Grant IndivuHeart), la Fondation allemande du cœur et la ville libre et hanséatique de Hambourg.
Materials
| EHT analysis intrument | EHT Technologies GmbH | A0001 | Software is included |
| EHT PDMS rack | EHT Technologies GmbH | C0001 | |
| EHT PTFE spacer | EHT Technologies GmbH | C0002 | |
| EHT electrode | EHT Technologies GmbH | P0001 | |
| EHT pacing adapter/cable | EHT Technologies GmbH | P0002 | |
| 24-well-plate | Nunc | 144530 | |
| 6 well-cell culture plate | Nunc | 140675 | |
| 15 ml falcon tube, graduated | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 831,830 | |
| Spinner flask | Integra | 182 101 | |
| Stirrer Variomag/ Cimarec Biosystem Direct | Thermo scientific | 70101 | Adjust rotor speed to 40 rpm |
| T175 cell culture flask | Sarstedt | 831,812,002 | |
| V-shaped sedimentation rack | Custom made at UKE Hamburg | na | |
| 10× DMEM | Gibco | 52100 | |
| 1-Thioglycerol | Sigma Aldrich | M6145 | |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma Aldrich | 49752 | |
| Activin-A | R&D systems | 338-AC | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-019 | |
| Aprotinin | Sigma Aldrich | A1153 | |
| Aqua ad injectabilia | Baxter GmbH | 1428 | |
| B27 PLUS insulin | Gibco | 17504-044 | |
| BMP-4 | R&D systems | 314-BP | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| DMEM | Biochrom | F0415 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | |
| DNase II, type V (from bovine spleen) | Sigma | D8764 | |
| Dorsomorphin | abcam | ab120843 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10437028 | |
| FGF2 | Miltenyi Biotec | 130-104-921 | |
| Fibrinogen (bovine) | Sigma Aldrich | F8630 | |
| Geltrex | Gibco | A1413302 | For coating: 1:200 dilution |
| HBSS w/o Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14175-053 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Horse serum | Life technologies | 26050088 | |
| Human serum albumin | Biological Industries | 05-720-1B | |
| Insulin, human | Sigma Aldrich | I9278 | |
| L-Glutamin | Gibco | 25030-024 | |
| Lipidmix | Sigma Aldrich | L5146 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | For EHT reconsitutionmix. |
| N-Benzyl-p-Toluenesulfonamide | TCI | B3082-25G | |
| PBS w/o MgCl2/CaCl2 | Biochrom | 14190 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | P2443 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma Aldrich | P8136 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich | S5261 | |
| TGFß1 | Peprotech | 100-21 | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | T7513 | |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T8158 | |
| Y-27632 | Biorbyt | orb6014 | |
| hiPSC | Custom made at UKE hamburg | na | |
| iCell cardiomyocytes kit | Cellular Dynamics International | CMC-100-010-001 | |
| Pluricyte cardiomyocyte kit | Pluriomics | PCK-1.5 | |
| Cor.4U – HiPSC cardiomyocytes kit | Axiogenesis AG | Ax-C-HC02-FR3 | |
| Cellartis cardiomyocytes | Takara Bio USA, Inc. | Y10075 |
Referências
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