Purificación de ADN de alto peso molecular genómico de oídio para Long-Read Sequencing
Summary
Described here is a method for the extraction, purification, and quality control of genomic DNA from the obligate biotrophic fungal pathogen, powdery mildew, for use in long-read genome sequencing.
Abstract
Los hongos oídio son un grupo de económicamente importantes patógenos fúngicos de plantas. Se sabe relativamente poco acerca de la biología molecular y la genética de estos patógenos, en parte debido a la falta de recursos genéticos y genómicos bien desarrolladas. Estos organismos tienen, genomas repetitivas grandes, que han hecho la secuenciación del genoma y montaje prohibitivamente difícil. A continuación, describimos métodos para la recogida, extracción, purificación y control de calidad de la evaluación de ADN genómico de alto peso molecular a partir de especies de moho uno pulverulentos, Golovinomyces cichoracearum. El protocolo descrito incluye la rotura mecánica de las esporas, seguido de una extracción de ADN genómico optimizado fenol / cloroformo. Un rendimiento típico fue de 7 g de ADN por cada 150 conidios mg. El ADN genómico que se aísla usando este procedimiento es adecuado para la secuenciación de larga leer (es decir,> 48,5 kpb). medidas de control de calidad para asegurar el tamaño, el rendimiento y pureza del ADN genómico son tambiéndescrito en este método. La secuenciación del ADN genómico de la calidad descrita aquí permitirá que para el montaje y la comparación de varios genomas oídio, que a su vez dará lugar a una mejor comprensión y un mejor control de este patógeno agrícola.
Introduction
Cenicillas son un grupo de obligado planta de hongos patógenos que biotrófica, tomados en conjunto, son la principal causa de enfermedades de las plantas en todo el mundo 1. Hay más de 900 especies descritas de oídio, que se han agrupado en cinco tribus taxonómicamente dentro de la familia Erisyphaceae 2. Debido tanto a su importancia económica y la relación íntima que desarrollan con sus anfitriones, las enfermedades de moho han sido objeto de investigación para> 100 años. Tras la infección, oídios provocan cambios drásticos en la estructura celular, el metabolismo y la biología molecular de sus anfitriones, en beneficio de este patógeno. Sin embargo, el estudio de oídios es particularmente difícil debido a su estilo de vida obligado, y el crecimiento del hongo en cultivo puro todavía no se ha descrito 3, 4, 5,"xref"> 6, 7, 8. Fiable transformación, estable genética de cenicillas aún no ha logrado también ha sido, a pesar de la transformación transitoria se ha reportado en algunas especies 9, 10.
La secuenciación y ensamblaje de genomas de moho en polvo ha demostrado ser difícil debido a una serie de características de la propia genoma. Genomas de moho en polvo son grandes (120 a 180 Mbp) en relación con otros genomas de hongos, y se componen de 60 – 90% de elementos repetitivos distribuidas uniformemente 11. Estos elementos incluyen repeticiones terminales no largos, así como elementos repetitivos no categorizados. Dos formas especiales de una sola especie oídio, Blumeria graminis f. sp. hordei y f. sp. tritici (Bgh y Bgt, respectivamente), así como el polvo de uva moho Erysiphe necator, tienen abejan secuenciaron, y los proyectos de genomas de varios otros se han completado 12, 13, 14. La naturaleza repetitiva de los genomas ha hecho ensamblaje difícil, y el genoma Bgh terminado fue ensamblado en 6.989 supercontigs con un L50 de 2 Mb 12.
A pesar del gran genoma, los oídios parecen tener un pequeño número de genes de proteínas de codificación, con 5.845 y 6.540 genes predichos en Bgh y Bgt, respectivamente. Los mildius pulverulentos secuenciados también parecen carecer de al menos 99 genes esenciales que son esenciales en otros hongos, que es consistente con la dependencia de los hongos en su planta huésped para la supervivencia 11, 12, 13, 14.
Las secuencias repetitivas cerca de telómeros, centrómeros, RN ribosomalA arrays y regiones enriquecidas en elementos de transposición de genes están mal ensambladas a partir de estrategias de secuenciación-leer cortas y son a menudo insuficientemente representadas en asambleas del genoma 15. Se cree que estas regiones para ser responsable de muchos de los huecos que se producen en secuencias del genoma, y esto se aplica a los oídios con su amplia expansión de elementos repetitivos 16. Altamente regiones del genoma de plástico se encuentran a menudo en tales regiones repetitivas 3. Ellos sirven como un sitio de reordenamientos cromosómicos y, a menudo codifican genes bajo fuerte presión selectiva, tales como los genes que codifican las proteínas efectoras y los genes que codifican enzimas del metabolismo secundario. Los avances en una sola molécula de tecnologías de secuenciación de lectura larga proporcionan una solución potencial para la secuenciación a través de las regiones repetitivas de genomas 15. Por ejemplo, FAINO et al. (2015) encontraron que la inclusión de la secuencia larga leer tecnologías y m ópticoapping les permitió producir una secuencia de genoma GAP-menos por dos cepas de la planta de hongos patógenos dalia Verticillium, triplicando la proporción de secuencias repetitivas de ADN en el genoma, aumentando el número de anotaciones de genes (y reducir el número de parcial o falta anotaciones de genes ) y el genoma revelador reordenamientos 17.
Para emplear estas tecnologías de secuenciación de larga leer, altas concentraciones de ADN genómico de alta calidad, con un mínimo de tamaños> 20 kpb, son necesarios. Aquí describimos nuestros métodos para la recolección de conidial, la purificación de ADN de alto peso molecular a partir de conidios y nuestras evaluaciones de control de calidad utilizando las especies de moho en polvo Golovinomyces cichoracearum cultivadas en pepino 18. Este protocolo se basa en un protocolo desarrollado en el grupo de laboratorio B. Keller (Universidad de Zürich, Zürich Suiza) 13, 19e incluye varias modificaciones que condujeron a un aumento de los rendimientos de ADN y una mayor proporción de ADN> 48,5 kpb de tamaño. El protocolo también incluye medidas de control de calidad basado en las recomendaciones del Departamento de Energía de los Estados Unidos Joint Genome Institute 20, 21, 22.
La función de cada reactivo incluido en el tampón de lisis, y la justificación de cada etapa de purificación, son como se describe en Henry (2008) 23. Disponibles protocolos publicados para el aislamiento de ADN genómico de alto peso molecular a partir de tejidos vegetales y microbianas también fueron consultados durante el diseño de este protocolo 24, 25, 26, 27, 28.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con el fin de obtener ADN puro, de alto peso molecular genómico de la obligado hongos oidio biotrófico, una versión modificada de los métodos descritos anteriormente se desarrolló 30. El rendimiento promedio utilizando este protocolo optimizado es 7 g de ADN por 150 conidios mg, una duplicación de los rendimientos obtenidos con un protocolo anterior. Además, el tamaño promedio se incrementó de aproximadamente 20 kpb a más de 48,5 kpb. Este protocolo se ha optimizado en el sistema ci…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This protocol was developed in support of a Joint Genome Institute-Community Sequencing Project (#1657). The work was supported in part by the Philomathia Foundation, the National Science Foundation (#0929226) and the Energy Biosciences Institute to S. Somerville; and by Swiss National Science Foundation (#310030_163260) to B. Keller. We would like to thank our colleagues, M. Figureroa and M. Miller (University of Minnesota), R. Panstruga (RWTH Aachen University), C. Pedersen (University of Copenhagen), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (University of California Berkeley), M. Wildermuth (University of California Berkeley), R. Wise (Iowa State University) and S. Xiao (University of Maryland) for their generous advice and for volunteering their protocols as we developed the protocol described here.
Materials
| MM400 Ball Mill | Retsch | 20.745.0001 | Or equivalent ball mill |
| 2mL tubes for ball milling | Sarstedt | 72.694.007 | |
| 5/32" stainless steel milling balls | OPS Diagnostics | GBSS 165-5000-01 | |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 65°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Microprocessor controlled 280 Series Water Bath Preset to 37°C | Thermo Fisher Scientific | 2825 | Or equivalent water bath |
| Eppendorf 5417R refrigerated microcentrifuge | Krakeler Scientific | 38-022621807 | Or equivalent microcentrifuge |
| Chlorform:IAA (24:1 v/v) | Sigma-Aldrich | C0549 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1 v/v) | Thermo Fisher Scientific | 15593031 | Hazardous in case of skin contact or inhalation. Wear nitrile gloves, protective eyewear, lab coat and work in chemical hood |
| 100% Isopropanol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| 100% Ethanol | Sigma-Aldrich | 34923 | Chill to -20°C prior use |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Rnase, Dnase-free (10mg/ml) | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| Potassium metabisulfite | Sigma-Aldrich | P2522 | |
| Sodium Lauryl Sacroinate | Sigma-Aldrich | L9150 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269 | |
| Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme | Staples | 423263 | Or equivalent eyewear |
| High Five COBALT nitrile gloves, LARGE | Neta Scientific | HFG-N193 | Or equivalent gloves |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain 10,000X in water | Biotium | 41003 | |
| Ethidium Bromide 10mg/ml | Biotium | 40042 | Hazardous in case of skin contact. Wear nitrile gloves and protective eyewear |
| Agarose Ultrapure Bioreagent | VWR International LLC | JT4063 | |
| GeneRuler 1kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | FERSM1332 | |
| 8-48kb CHEF DNA size standards | Bio-Rad | 170-3707 | |
| Pippin Prep | Life Technologies Corporation | 4472172 | Or equivalent pulse-field gel aparatus |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001042 | Or equivalent growth chamber |
| Percival Growth Chamber | Percival | AR66LXC9 | |
| NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | Or equivalent spectrophotometer |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Fisher Scientific | B49 | Dilute 1/50 with water before use (to 1X) |
| TE Buffer | Thermo Fisher Scientific | 12090015 | |
| Tris-Borate-EDTA, 10X Solution (Electrophoresis) | Thermo Fisher Scientific | BP13334 | Dilute 1/10 with water before use (to 1X) |
| Liquid Nitrogen | Liquid nitrogen (-196 °C) is a freezing hazard. It will also expand rapidly upon warming and should not keep in a tightly closed container |
Referências
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