Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics
Summary
Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.
Abstract
Intrinsiek ontvouwen eiwitten (IDP) zijn lang een uitdaging structurele biologen vanwege hun gebrek aan stabiele secundaire structuurelementen. Waterstof deuterium uitwisseling (HDX) gemeten bij snelle tijdschalen is bij uitstek geschikt voor structuren en waterstofbinding netwerken die kort worden bevolkt detecteren, waardoor de karakterisering van voorbijgaande conformeren in natieve ensembles. Koppeling van HDX aan massaspectrometrie biedt een aantal belangrijke voordelen, waaronder een hoge gevoeligheid, lage monster consumptie en geen beperking op eiwit grootte. Deze techniek is sterk gevorderd in de afgelopen tientallen jaren, inclusief de mogelijkheid om HDX etikettering de gaten te houden op de milliseconde tijdschaal. Bovendien, door het opnemen van de HDX werkstroom naar een microfluïdisch platform behuizing een zuur protease microreactor, kunnen wij dynamische eigenschappen lokaliseren peptideniveau. In deze studie tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie (Tresi-MS) gekoppeld aan HDX was gebruikt om een gedetailleerd beeld van de resterende structuur in het tau-eiwit, alsook de conformationele veranderingen geïnduceerd na hyperfosforylering verschaffen.
Introduction
In de afgelopen jaren zijn aanzienlijke vooruitgangen geboekt bij de ontwikkeling van analytische technieken ter eiwitstructuur en dynamica 1, 2, 3, 4 meten. Terwijl röntgenkristallografie blijft het principe voor het bepalen van eiwitstructuur worden hoge concentraties van eiwitten nodig en uitgebreide optimalisering vereist diffractie Kristallen produceren. Eiwitten die moeilijk te kristalliseren zijn, zoals membraangeassocieerd en intrinsiek ontvouwen eiwitten zijn klassiek bestudeerd door waterstof-deuterium uitwisseling (HDX) NMR 5. Echter, de laatste decennia koppeling van electrospray ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS) naar HDX is snel aan populariteit 6, 7.
Massaspectrometrie biedt een oplossingveel van de beperkingen veroorzaakt door röntgen kristallografie en NMR. Vooral MS zeer gevoelig (nM tot pM concentraties vereist), en er vrijwel geen grens aan eiwitgrootte. Daarnaast is de hoge inschakelduur MS analyse maakt de mogelijkheid bestuderen eiwitten ze enzymatisch omzet, verkeerd vouwen, complexering en andere biologisch relevante processen ondergaan. Deze processen treden vaak op de milliseconde tweede tijdschaal en vereisen snel mengen van reagentia voorafgaand aan analyse.
De ontwikkeling van tijdsopgeloste elektrosprayionisatie (Tresi) door Wilson en KONERMANN in 2003 toegestaan reacties te kunnen houden in pseudo-real time door ESI-MS. Hun opstelling opgenomen een capillair mixer met een traploos verstelbare reactiekamer volume 8. De inrichting bestaat uit twee concentrische capillairen, met binnencapillair afgesloten en een inkeping in de zijkant gesneden om voor het mengen in de smalle inter-capillairy ruimte van de inkeping aan het uiteinde van de binnenste capillair (typisch 2 mm). Toegepast op HDX experimenten, de binnencapillair draagt het eiwit van belang, de uitwendige capillaire draagt het etiket D2O oplossing, die vervolgens ondergaat mengen met het eiwit alvorens de instelbare reactiekamer waardoor HDX etiket vóór directe overdracht in de ESI bron.
In het kort HDX voert backbone amide waterstoffen ondergaan uitwisseling met deuterium atomen in oplossing 9, 10. De uitwisseling van base gekatalyseerde bij fysiologische pH, met een zuur-katalyse steeds heersende pH beneden ongeveer 2,6. De koers is gebaseerd op vier factoren: pH, temperatuur, oplosmiddel toegankelijkheid en intramoleculaire waterstofbinding. Als de eerste twee factoren gedurende het experiment, de koers, vooral in peptide hoofdketen amide posities constant worden gehouden, primair dependentaan eiwitstructuur 11. Strak gevouwen gebieden met uitgebreide, stabiele waterstofbinding netwerken α-helices en β-sheets zal nemen deuterium in hoofdzaak langzamer vergeleken met lussen en ongeordende gebieden (en soms helemaal niet) 12. Dit maakt globale eiwitanalyse, waarbij verstoringen in structuur (bijv., Na aggregatie of substraatbinding) leiden tot verschillende deuterium opname (figuur 1).
De kinetische capillaire menger in een microfluïdisch platform met een proteolytisch kamer voor lokalisatie van het deuterium opname worden opgenomen. Deze proteolytische kamer wordt gehouden bij lage pH om effectief blussen de uitwisselingsreactie en vereist een geïmmobiliseerd zuur protease om het eiwit te verteren in gelokaliseerde peptiden (figuur 2). Monitoring backbone uitwisseling op milliseconde naar tweede tijdschalen is vooral belangrijk voor dekarakterisering van conformationele veranderingen binnen moeilijk lusgebieden gesmolten globules en intrinsiek ontvouwen eiwitten (IDP) 13, 14 te karakteriseren. Als alternatief kunnen Tresi-HDX ook worden gebruikt om eiwitten die momenteel een opgelost atoomstructuur door de werkwijzen van röntgenkristallografie en NMR geen kenmerkend gebruik deuterium uitwisseling gekoppeld met de COREX-algoritme (DX-COREX) benadering 15, 16. Deze gedetailleerde protocol Tresi-HDX gelden voor tau, een IDP bestuderen, zowel in het oorspronkelijke vorm, alsmede het pathogene hypergefosforyleerde toestand. Terwijl inheemse tau is een van de meest goed bestudeerd ontheemden, is er weinig bekend over de amyloïdogene tegenhanger 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hoewel structurele biologie werkwijzen, zoals röntgen kristallografie en NMR zijn voordelig omdat zij zeer gedetailleerd structuren van eiwitten, deze beelden vaak statisch. De karakterisering van voorbijgaande soorten en zwak gestructureerde domeinen blijft ongrijpbaar wanneer onderzocht door deze conventionele werkwijzen. Daarom, met het oog op dynamische inzichten over dit soort systemen te krijgen is het belangrijk om te werken aan een snelle tijdschalen. We hebben met succes Tresi-HDX-MS toegepast op gedetailleerd…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Materials
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
Referências
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization?. Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development – A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
