시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한
Summary
구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 – 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.
Abstract
본질적으로 무질서 단백질 (실향민) 길이 때문에 안정적인 이차 구조 요소의 부족 구조적 생물 학자에 도전하고있다. 수소 – 중수소 빠른 시간 척도로 측정 교환 (HDX)는 네이티브 앙상블 일시적인 이형태 체의 특성을 허용 간단히 채워진 구조와 수소 결합 네트워크를 검출하는 고유 적합하다. 질량 분석에 HDX의 커플 링은 높은 감도, 낮은 샘플 소비와 단백질의 크기에 제한을 포함하여 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 이 기술은 밀리 초 시간 규모 HDX 라벨 시간을 모니터링 할 수있는 기능을 포함하여, 지난 몇 년간 크게 발전했다. 또한, 산성 프로테아제 마이크로 리액터 하우징 미세 유체 플랫폼 상 HDX 흐름을 도입함으로써, 우리는 펩타이드 레벨에서의 동적 속성을 지역화 할 수있다. 본 연구에서는 시간 – 해결 된 전기 분무 이온화 질량 분석법 (TRESI-MS)는 HDX의 WA 결합S는 타우 단백질에 잔여 구조의 상세한 그림뿐만 아니라 과인산에 유도 된 형태 적 변화를 제공하기 위해 사용된다.
Introduction
지난 몇 년 동안 상당한 발전 단백질 구조와 역학 1, 2, 3, 4를 측정하기위한 분석 기술의 개발되었습니다. X 선 결정학은 단백질 구조를 결정하기위한 원리 공구 유지하는 동안, 단백질의 고농도가 필요하다 광범위한 최적화 회절 품질의 결정을 제조 할 필요가있다. 이러한 막과 본질적으로 연관된 장애 단백질로서 결정화하기 어려운 단백질, 고전 수소 – 중수소 교환 (HDX) NMR (5)에 의해 연구되었다. 그러나 최근 수십 년간, HDX에 전기 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS)의 커플 링은 빠르게 인기 6, 7 얻고있다.
질량 분석은 솔루션을 제공합니다X 선 결정학 및 NMR로 인한 제약 사항에. 특히, MS는 매우 민감한 (필수 μM 농도로 ㎚)이고, 단백질의 크기에는 제한이 거의 없다. 또한, MS 분석의 높은 듀티 사이클은 효소 회전율, 미스 폴딩, 복합체 및 기타 중요한 생물학적 과정을 겪는다 같은 단백질 연구의 가능성을 허용한다. 이러한 프로세스는 종종 두 번째 규모로 밀리 초에서 발생 및 분석에 앞서 시약의 신속한 혼합이 필요합니다.
2003 허용 반응에서 윌슨과 Konermann 소요 시간 – 해결 된 전기 분무 이온화 (TRESI)의 개발은 ESI-MS에 의한 의사 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. 이들의 설정은 계속 조정 가능한 반응 실 용적 8 모세관 믹서로 통합된다. 장치는 좁은 상호 capillar 내 혼합을 허용하도록 밀봉 내부 모세관의 측면으로 잘라 노치 두 동심 모세관 이루어져내부 모세관 (일반적으로 2mm)의 단부에 절 결부의 공간 Y. HDX 실험에 적용 할 때, 상기 내부 모세관 관심 단백질을 운반 외측 모세관 표지 D를 다음 ESI로 직접 전송하기 전에 HDX 라벨링 있도록 조절 반응 챔버로 들어가기 전에 단백질과 혼합 겪는다 2 O 용액을 운반 출처.
간단히, HDX 용액 9, 10 중수소 원자 교환을 진행 백본 아미드 수소에 의존한다. 교환은 염기 – 촉매 생리적 pH에서, 산 촉매는 약 2.6 이하의 pH에서 함께 널리 사용되고있다. 산도, 온도, 용매 접근성과 분자간 수소 결합 : 교환 율은 네 가지 요인에 기초한다. 이전의 두 가지 요인이 실험 특히 펩티드 백본 아미드 위치에서의 환율에 걸쳐 일정하게 유지되기 때문에, 우선적 인 dependen단백질 구조 (11)에 t. 밀접 루프와 무질서 영역 (때때로 전혀) (12)에 비해 실질적으로 느린 속도로 중수소 소요될 것이다 α 나선과 β-시트 광범위한 안정된 수소 결합 네트워크 영역으로 접혀. 이 글로벌 단백질 분석을 가능 여기서 구조 섭동 (예., 응집 또는 기질 결합시) 중수소 흡수 (도 1)에 다른 리드.
운동 모세관 믹서 중수소 흡수 제이션을위한 단백질 분해 챔버를 포함하는 미세 유체 플랫폼으로 통합 될 수있다. 이러한 단백질 분해 챔버 효과적으로 교환 반응을 급냉시키기 위해 낮은 pH로 유지하고, 지역화 된 펩티드 (도 2)로 단백질을 소화하기 위해 고정화 산 프로테아제를 필요로한다. 두 번째 시간 규모에 밀리 초에서 모니터링 백본 교환은 특히 중요하다어려운 내 구조적 변화 특성 루프 영역, 용융 구체와 본질적으로 무질서 단백질 (실향민) (13) (14)을 특성화한다. 대안 적으로, TRESI-HDX 또한 COREX 알고리즘 (DX-COREX) 방법 (15, 16)에 결합 된 중수소 교환을 이용하여, 현재 X 선 결정학 및 NMR의 방법을 통해 해결할 원자 구조를 갖고 있지 않은 단백질을 특성화하는데 사용될 수있다. 이 상세한 프로토콜은 병원성 hyperphosphorylated 상태입니다으로 모두가 기본 형태뿐만 아니라의에, 타우, 실향민을 연구하기 위해 TRESI – HDX을 적용합니다. 기본 타우가 가장 잘 연구 실향민 중 하나이지만, 약간은 아밀로이드 대응 (13)에 대한 알려져있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그들이 단백질의 매우 상세한 구조를 제공하기 때문에 이러한 X 선 결정학 및 NMR 구조 생물학 등의 방법이 유리하지만, 이러한 이미지들은 정적이다. 과도 종과 약하게 구조화 된 도메인의 특성은 이러한 기존의 방법으로 공부하면 어려운되고 있습니다. 따라서, 이러한 유형의 시스템에 동적 통찰력을 얻기 위해이 빠른 시간 규모에서 일을하는 것이 중요합니다. 우리는 성공적으로 지역화 된 펩?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Materials
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
Referências
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