resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas
Summary
flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.
Abstract
proteínas intrinsecamente desordenados (PDI) têm sido um desafio para os biólogos estruturais devido à sua falta de elementos da estrutura secundária estável. Hidrogénio-deutério Exchange (HDX) medido em escalas de tempo rápidos é exclusivamente adequado para detectar estruturas e redes de ligação de hidrogénio que são rapidamente povoadas, permitindo a caracterização de confórmeros transientes em conjuntos nativas. Acoplamento de HDX para espectrometria de massa oferece diversas vantagens, incluindo alta sensibilidade, baixo consumo de amostra e sem restrição no tamanho da proteína. Esta técnica tem avançado muito nas últimas décadas, incluindo a capacidade de monitorar tempos de rotulagem HDX na escala de tempo de milissegundos. Além disso, por incorporação do fluxo de trabalho HDX para uma plataforma de microfluidos que aloja um microrreactor de protease ácida, que são capazes de localizar as propriedades dinâmicas ao nível péptido. Neste estudo,-tempo resolvido com ionização por electrospray Espectrometria de Massa (Tresi-MS) acoplado a HDX was usadas para fornecer uma imagem detalhada da estrutura residual na proteína tau, bem como as mudanças conformacionais induzidas mediante a hiperfosforilação.
Introduction
Ao longo das últimas décadas, avanços significativos foram feitos no desenvolvimento de técnicas analíticas concebidas para medir a estrutura da proteína e da dinâmica 1, 2, 3, 4. Enquanto a cristalografia de raios-X permanece o princípio ferramenta para a determinação da estrutura de proteínas, altas concentrações de proteína são necessárias e optimização extensa é necessária para a produção de cristais de qualidade de difracção. As proteínas que são difíceis de cristalizar, tal como as proteínas associadas a membranas e intrinsecamente desordenados foram classicamente estudado por permuta hidrogénio-deutério (HDX) RMN 5. No entanto, nas últimas décadas, o acoplamento de espectrometria de massa por ionização por electropulverização (ESI-MS) para HDX foi rapidamente ganhou popularidade 6, 7.
espectrometria de massa oferece uma soluçãoa muitas das restrições impostas por cristalografia de raios X e RMN. Em particular, é altamente sensível MS (nM para as concentrações necessárias uM), e não há praticamente nenhum limite no tamanho da proteína. Além disso, o ciclo de alta de análise MS permite a possibilidade de estudar proteínas que se submetem a rotatividade enzimática, o enrolamento incorrecto, complexação e outros processos biologicamente relevantes. Estes processos muitas vezes ocorrem na milisegundo para a segunda escala de tempo e necessitam de uma rápida mistura dos reagentes antes da análise.
O desenvolvimento de resolvida no tempo com ionização por electrospray (Tresi) por Wilson e Konermann em 2003 reacções permitidos para ser monitorado em tempo real pelo pseudo-ESI-MS. A sua configuração incorporado um misturador capilar com um volume de câmara de reacção continuamente ajustável 8. O dispositivo consiste em dois capilares concêntricos, com o capilar interior selado e um entalhe cortado em seu lado para permitir a mistura no interior do estreito inter-capilary espaço do entalhe para a extremidade do capilar interna (tipicamente de 2 mm). Quando aplicada a experiências HDX, o capilar interior transporta a proteína de interesse, o capilar exterior leva a rotulagem D 2 O solução, que é então submetido a misturar com a proteína antes de entrar na câmara de reacção ajustável permitindo a etiquetagem HDX antes da transferência directa para o ESI fonte.
Resumidamente, HDX depende de hidrogénios de amida do esqueleto submetidos troca com átomos de deutério em solução de 9, 10. A troca é catalisada por base, a pH fisiológico, com ácido-catálise tornar-se predominante a um pH abaixo de aproximadamente 2,6. A taxa de conversão é baseada em quatro factores principais: pH, temperatura, solvente de acessibilidade e de ligação de hidrogénio intramolecular. À medida que os primeiros dois factores são mantidas constantes ao longo da experiência, a taxa de câmbio, particularmente nas posições amida esqueleto peptídico, é principalmente dependent na estrutura da proteína 11. Regiões com extensas, redes de ligação de hidrogénio estável em hices e folhas? Firmemente dobrado ocupará deutério a taxas substancialmente mais lentas em comparação com regiões de loops e desordenados (e, por vezes, não em todos) 12. Isto permite uma análise global de proteínas, em que as perturbações na estrutura (por exemplo., Mediante a ligação do substrato ou a agregação) conduzem a diferentes captação de deutério (Figura 1).
O misturador capilar cinética pode ser incorporada uma plataforma de microfluidos que contém uma câmara proteolítica para localização da absorção de deutério. Esta câmara proteolítica é realizada a um pH baixo, a fim de extinguir eficazmente a reacção de permuta, e requer uma protease ácida imobilizada, a fim de digerir a proteína em péptidos localizados (figura 2). Monitorando o Exchange backbone em milissegundo para escalas segunda vez é especialmente importante para ocaracterização de alterações conformacionais no difícil caracterizar regis de ansa, glóbulos fundidos, e proteínas intrinsecamente desordenados (PDI) 13, 14. Alternativamente, Tresi-HDX também podem ser utilizados para caracterizar as proteínas que neste momento não têm uma estrutura atómica resolvido através dos métodos de cristalografia de raios-X e RMN, usando troca de deutério acoplado ao algoritmo Corex (DX-Corex) abordagem 15, 16. Este protocolo detalhado vai aplicar-Tresi HDX para estudar tau, um IDP, em ambos sua forma nativa, assim como o respectivo estado hiperfosforilado patogénico. Enquanto tau nativa é um dos DIs mais bem estudados, pouco se sabe sobre o seu homólogo amiloidog�ico 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto os métodos de biologia estrutural, tais como cristalografia de raios-X e RMN são vantajosos porque proporcionam estruturas extremamente detalhadas de proteínas, estas imagens são frequentemente estático. A caracterização das espécies transientes e domínios fracamente estruturados continua a ser elusiva quando estudados por estes métodos convencionais. Portanto, a fim de obter insights dinâmicos sobre estes tipos de sistemas é importante para trabalhar em escalas de tempo rápido. Temos aplicado com …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Materials
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
Referências
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