flexibilidade conformacional desempenha um papel crucial na função da proteína. Aqui, nós descrevemos o uso de espectrometria de massa por ionização por electropulverização resolvida no tempo acoplado a troca de hidrogénio-deutério para sondar as rápidas mudanças estruturais que conduzem a função de proteínas ordenadas e desordenadas.
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Artigo de método
resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas
Neste artigo
Resumo
Resumo
proteínas intrinsecamente desordenados (PDI) têm sido um desafio para os biólogos estruturais devido à sua falta de elementos da estrutura secundária estável. Hidrogénio-deutério Exchange (HDX) medido em escalas de tempo rápidos é exclusivamente adequado para detectar estruturas e redes de ligação de hidrogénio que são rapidamente povoadas, permitindo a caracterização de confórmeros transientes em conjuntos nativas. Acoplamento de HDX para espectrometria de massa oferece diversas vantagens, incluindo alta sensibilidade, baixo consumo de amostra e sem restrição no tamanho da proteína. Esta técnica tem avançado muito nas últimas décadas, incluindo a capacidade de monitorar tempos de rotulagem HDX na escala de tempo de milissegundos. Além disso, por incorporação do fluxo de trabalho HDX para uma plataforma de microfluidos que aloja um microrreactor de protease ácida, que são capazes de localizar as propriedades dinâmicas ao nível péptido. Neste estudo,-tempo resolvido com ionização por electrospray Espectrometria de Massa (Tresi-MS) acoplado a HDX was usadas para fornecer uma imagem detalhada da estrutura residual na proteína tau, bem como as mudanças conformacionais induzidas mediante a hiperfosforilação.
Introdução
Ao longo das últimas décadas, avanços significativos foram feitos no desenvolvimento de técnicas analíticas concebidas para medir a estrutura da proteína e da dinâmica 1, 2, 3, 4. Enquanto a cristalografia de raios-X permanece o princípio ferramenta para a determinação da estrutura de proteínas, altas concentrações de proteína são necessárias e optimização extensa é necessária para a produção de cristais de qualidade de difracção. As proteínas que são difíceis de cristalizar, tal como as proteínas associadas a membranas e intrinsecamente de....
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Protocolo
NOTA: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Os fumos produzidos pela ablação a laser de poli (metacrilato de metilo) (PMMA) pode ser tóxico. Certifique-se de que o gravador do laser está ligado a um sistema de ventilação funcionando. Use todas as práticas de segurança adequadas ao construir o dispositivo microfluídico incluindo o uso de controles de engenharia (exaustor, recipiente para objectos cortantes) e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, máscara, luvas, jaleco, calça de corpo inteiro, sapatos fechados). É de extrema importância de usar reagentes de grau Cromatografia Líquida de Alto Dese....
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Resultados
perfis de digestão de tau-fosfo nativa e foram semelhantes, dando origem a uma cobertura sequência de 77,1 e 71,7% respectivamente. valores de absorção de deutério de cada péptido foi determinada por ajustamento dos distribuições isotópicas observadas com as distribuições teóricas geradas usando um software Fortran desenvolvido internamente. Os melhores distribuições de montagem são mostrados (Figura 3a), juntamente com os valores de absorção de deutério associados. perf.......
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Discussão
Enquanto os métodos de biologia estrutural, tais como cristalografia de raios-X e RMN são vantajosos porque proporcionam estruturas extremamente detalhadas de proteínas, estas imagens são frequentemente estático. A caracterização das espécies transientes e domínios fracamente estruturados continua a ser elusiva quando estudados por estes métodos convencionais. Portanto, a fim de obter insights dinâmicos sobre estes tipos de sistemas é importante para trabalhar em escalas de tempo rápido. Temos aplicado com sucesso Tresi.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. Markus Zweckstetter por fornecer o arquivo de coordenadas pdb para o conjunto tau 'nativo' previsto a partir de seu trabalho de RMN, com ferramentas de análise fornecidas pelo Dr. Adnan Sljoka. O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo programa ENGAGE Grant do Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (NSERC).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Poli(metacrilato de metila) ou PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Capilar de Vidro de Sílica Fundida | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75 µ m, OD: 150 µ m |
| Capilares Metálicos | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga - 89875K99 | |
| Tubo de Etileno Propileno Fluorado (FEP) | IDEX | 1477 1548 | ID: 0.007", OD: 1/16" ID: 0,020", OD: 1/16" |
| Cortador de tubos de polímero padrão | IDEX | A-327 | para 1/16" e 1/8" Tubo OD |
| Micro T de mistura estática | IDEX | M-540 | para 1/16 " Tubulação OD |
| ou | |||
| Tee de Aço Inoxidável, 0.25 mm Furo | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | para 1/16 " Tubo OD |
| PEEK Tee para 1/16 " Tubulação OD | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Fêmea para Fêmea Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Porca de Asa Dupla | IDEX | F-300 | |
| Virola para 1/16" Tubulação OD | IDEX | F-142 | |
| Ferramenta Rotativa Série 100 | Dremel | F013010001 | |
| Jobmate | 1/64" de espessura | ||
| Fisher Scientific | 12-563-411 | ||
| Ferro de Solda | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal | ||
| Seringas | Hamilton | 81220 | 500 µ Capacidade L |
| Bombas de Seringa | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Nome | Empresa | Número do Catálogo< | strong>Comentários |
| Reagentes | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsina da mucosa gástrica suína | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Óxido de deutério | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Ácido acético | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grau Água | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Acetato de amônio | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Fosfato de Sódio | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Cloreto de Sódio | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Software/Ferramentas Online | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Calculadora | Versão 6.49 | Ferramenta MS de Código Aberto | |
| mMass | Versão 5.5.0 | Ferramenta MS de Código Aberto | |
| ExPASy FindPept | Instituto Suíço de Bioinformática | ||
| SigmaPlot | Software Systat | Versão 11.0 | |
| PyMOL | Schrö | dinger Versão 1.5.0.4 | |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Instrumentos | |||
| QStar Espectrômetro de Massa Híbrido Q-TOF Elite | AB SCIEX |
Referências
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. B....
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Reimpressões e permissões
