Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики
Summary
Конформационная гибкость играет важную роль в функции белка. Здесь мы опишем использование с временным разрешением масс-спектрометрии с ионизацией электрораспыления в сочетании с обменом водородно-дейтериевого для зондирования быстрых структурных изменений, которые ведут функцию в упорядоченных и неупорядоченных белках.
Abstract
Искробезопасный неупорядоченные белки (ВПЛ) уже давно вызов структурных биологи из-за отсутствия стабильных элементов вторичной структуры. Водород-дейтерий Обмен (HDX), измеренный при быстрых временных масштабах уникально подходит для обнаружения структур и водородных связи сетей, которые кратко заселенные, что позволяет для характеристики переходных конформеров в нативных ансамблях. Взаимодействие с HDX масс-спектрометрии предлагает несколько ключевых преимуществ, в том числе высокой чувствительностью, низким потреблением образца и без ограничений по размеру белка. Этот метод значительно продвинулся вперед в течение последних нескольких десятилетий, в том числе возможности контролировать HDX раз маркировки на временной шкале миллисекунды. Кроме того, путь включения рабочего процесса HDX на микрофлюидальную платформу для дома кислой протеазы микрореактора, мы можем локализовать динамические свойства на уровне пептида. В этом исследовании, времяразрешенная ионизацией электрораспылением масс-спектрометрии (МС-TRESI), соединенный с HDX ваы используются для обеспечения детальную картину остаточной структуры в тау-белка, а также конформационные сдвиги, индуцированные при гиперфосфорилированию.
Introduction
За последние несколько десятилетий, значительные достижения были сделаны в разработке аналитических методов , предназначенных для измерения белковой структуры и динамики 1, 2, 3, 4. В то время как рентгеновская кристаллография остается принцип инструмента для определения структуры белка, высокие концентрации белка необходимы и обширные оптимизации требуются для получения кристаллов дифракционного качества. Белки, которые трудно кристаллизуется, такие как ассоциированные с мембранами и внутренне неупорядоченными белки классически были изучены с помощью водородного обмена-дейтерия (HDX) ЯМРА 5. Тем не менее, в последние десятилетия, связь с электрораспылением ионизации масс – спектрометрии (ESI-MS) на HDX быстро завоевала популярность 6, 7.
Масс-спектрометрия предлагает решениеко многим из ограничений, связанных с рентгеновской кристаллографии и ЯМР. В частности, МС обладает высокой чувствительностью (нМ до концентрации мкМ требуется), и не существует практически никаких ограничений на размер белка. Кроме того, высокий рабочий цикл анализа MS допускает возможность изучения белков, поскольку они подвергаются ферментативному обороту, неправильный фолдинг, комплексообразование и других биологически соответствующих процессы. Эти процессы часто происходят на миллисекунды до второй шкалы времени и требуют быстрого смешивания реагентов до анализа.
Развитие Времяразрешенной ионизации электрораспыления (TRESI) Вильсон и Konermann в 2003 году, разрешенных реакций, подлежащий мониторинг в псевдо-режиме реального времени с помощью ESI-MS. Их установка включена капиллярный смеситель с плавно регулируемым реакционным объемом камеры 8. Устройство состоит из двух концентрических капилляров, с внутренним капилляром запечатанного и насечкой разрежет на его сторону, чтобы обеспечить смешивание в узком интер-капилляреу пространства от надреза до конца внутреннего капилляра (обычно 2 мм). При нанесении на опытах HDX, внутренний капиллярная несет белок , представляющий интерес, наружный капиллярная несет на маркировку D 2 O раствор, который затем подвергается смешивания с белком перед входом в регулируемой реакционной камеры , что позволяет для маркировки HDX до прямой передачи в ESI источник.
Если коротко, то HDX полагается на магистральных амидных водородах , проходящих обмен с атомами дейтерия в растворе 9, 10. Обмен катализируемой основанием при физиологическом рН, с кислотно-катализ становится распространенным при рН ниже примерно 2,6. Скорость обмена основана на четыре основных факторах: рН, температура, доступность растворителя и внутримолекулярные водородные связи. В первых два фактора поддерживается постоянным в течение всего эксперимента, скорость обмена, особенно на пептидном остове позиции амидной, в первую очередь dependenт на структуру белка 11. Плотно сложенные участки с обширными, стабильных водородных связей сетей в альфа-спиралей и бета-листов будет занимать дейтерий , по существу , более медленными темпами по сравнению с петлями и неупорядоченных областей (а иногда и не на всех) 12. Это позволяет для глобального анализа белков, где возмущение в структуре (например., После агрегации или связывание субстрата) приводит к различному поглощению дейтерия (рисунок 1).
Кинетическая капиллярная смеситель может быть включена в микрожидкую платформу, содержащей протеолитическую камеру для локализации поглощения дейтерия. Эта протеолитическая камера удерживается при низком значении рНа в целях эффективного гашения реакции обмена, и требует иммобилизованной кислоты протеазы, чтобы переварить белка в локализованные пептиды (рисунок 2). Мониторинг магистральной обмен на миллисекундах до вторых временных масштабов особенно важна дляхарактеристика конформационных изменений в пределах трудно охарактеризовать областей петли, расплавленные глобулы и внутренне неупорядоченные белки (ВПЛ) 13, 14. В качестве альтернативы, TRESI-HDX может также использоваться , чтобы характеризовать белки , которые в настоящее время не имеют решаемой атомную структуру с помощью методов рентгеновской кристаллографии и ЯМР, используя обмен дейтерия в сочетании с алгоритмом COREX (DX-COREX) подход 15, 16. Этот подробный протокол будет применяться TRESI-HDX для изучения тау, МВУ, в обоих его нативной формы, а также это патогенные гиперфосфорилированного состояние. В то время как родной тау является одним из наиболее хорошо изученных ВПЛ, мало известно о его амилоидогенном аналоге 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как структурные методы биологии, такие как рентгеновская кристаллография и ЯМР являются предпочтительными, поскольку они обеспечивают чрезвычайно подробные структуры белков, эти изображения часто являются статичными. Характеристика переходных видов и слабо структуриров?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the ‘native’ tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.
Materials
| Poly(methyl methacrylate) or PMMA | Professional Plastics | SACR.250CCP | 8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm |
| Fused Silica Glass Capillary | Polymicro Technologies | 106815-0018 | ID: 75µm, OD: 150µm |
| Metal Capillaries | McMaster-Carr | 28 ga – 89875K97 30 ga – 89875K99 |
|
| Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing | IDEX | 1477 1548 |
ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16” |
| Standard Polymer Tubing Cutter | IDEX | A-327 | for 1/16” and 1/8” OD tubing |
| Micro Static Mixing Tee | IDEX | M-540 | for 1/16” OD tubing |
| or | |||
| Stainless Steel Tee, 0.25mm Bore | Valco Instruments Co., Inc. (VICI) | ZT1C | for 1/16” OD tubing |
| PEEK Tee for 1/16” OD Tubing | IDEX | P-727 | |
| 10-32 Female to Female Luer | IDEX | P-659 | |
| 10-32 PEEK Double-Winged Nut | IDEX | F-300 | |
| Ferrule for 1/16” OD Tubing | IDEX | F-142 | |
| 100 Series Rotary Tool | Dremel | F013010001 | |
| Cut-Off Discs | Jobmate | 1/64” thickness | |
| Stereomaster Digital Zoom Microscope | Fisher Scientific | 12-563-411 | |
| Soldering Iron | Mastercraft | 58-6301-2 | |
| VersaLaser | Universal Laser | ||
| Syringes | Hamilton | 81220 | 500µL capacity |
| Syringe Pumps | Harvard Apparatus | 70-4501 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| NHS-Activated Agarose | Fisher Scientific | 26196 | |
| Pepsin from Porcine Gastric Mucosa | Sigma-Aldrich | P6887-250MG | |
| Deuterium Oxide | Sigma-Aldrich | 151882-10X0.6ML | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 695092-100ML | |
| HPLC Grade Water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | A7330-500G | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software/Online Tools | |||
| CorelDraw X3 | Corel | ||
| Molecular Weight Calculator | Version 6.49 | Open Source MS Tool | |
| mMass | Version 5.5.0 | Open Source MS Tool | |
| ExPASy FindPept | Swiss Institute of Bioinformatics | ||
| SigmaPlot | Systat Software | Version 11.0 | |
| PyMOL | Schrödinger | Version 1.5.0.4 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer | AB SCIEX |
Referências
- Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
- Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
- Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization?. Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
- Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
- Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
- Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
- Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
- Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
- Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
- Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
- Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
- Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
- Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
- Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
- Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
- Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
- Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
- Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
- Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
- Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
- Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
- Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
- Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
- Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development – A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
- Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
- Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
- Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
- Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
- Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).
