ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר
Summary
תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.
Abstract
סחר חלבון הממברנה הבנה, הרכבה, וביטוי דורשים גישה מבדילה בין גרי אברונים התאיים ואלה מקומיים על קרום הפלזמה. מדידות קרינה מבוססת מסורתיות חוסר היכולת להבחין חלבונים בממברנה המתגוררים אברונים שונים. מתודולוגיות חוד החנית להתעלות שיטות מסורתיות על ידי צימוד fluorophores pH רגיש עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM). תאורה TIRF שמרגש המדגם עד כ 150 ננומטר מממשק זכוכית מדגם, ובכך להקטין רקע, הגדלת יחס אות לרעש, ושיפור הרזולוציה. היקף עירור TIRFM מקיף קרום הפלזמה האברונים סמוך כגון ER הפריפריה. Superecliptic pHluorin (ספטמבר) הוא גרסת pH רגישה של GFP. גנטי קידוד ספטמבר לתוך התחום התאי של חלבון הממברנה של עניין ממקם את fluorophore עלצד luminal של ER ובאזור התאי של התא. ספטמבר הוא פלורסנט כאשר pH גדול מ -6, אך נשאר במצב כבוי בערכי pH נמוכים. לכן, קולטני מתוייגים עם לזרוח ספטמבר כאשר המתגוררים reticulum endoplasmic (ER) או עם החדרת בקרום פלזמה (PM) אבל לא כאשר מרותק שלפוחית סחר או אברונים אחרים כגון Golgi. ה- pH התאי יכול להיות מותאם כדי להכתיב את הקרינה של קולטנים על קרום התא. ההבדל הקרינה בין תמונות TIRF ב- pH תאיים נייטרלי חומצי לאותו תא מתאים המספר היחסי של קולטנים על קרום התא. זה מאפשר מדידה בו זמנית של קולטנים תושב קרום תאיים ופלזמה. אירועי כניסת שלפוחית יחיד ניתן גם למדוד כאשר pH התאי הוא ניטראלי, המקביל ל שלפוחית סחר pH נמוכה פיוזינג עם קרום הפלזמה ומעבר למצב ניאון. versatil זהטכניקת דואר ניתן לנצל כדי ללמוד לוקליזציה, ביטוי, וסחר של חלבונים בממברנה.
Introduction
שינויים בביטוי קולטן, הפצה, והרכבה חוברו למגוון רחב של מחלות, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סיסטיק פיברוזיס, והתמכרות לסמים 1, 2, 3, 4, 5. לדוגמא, ניקוטין הליגנדים ניקוטינית אחרים להשפיע על הסחר של קולטני אצטילכולין ניקוטינית (nAChRs) מובילים לשינויים בסחר, ביטוי upregulation 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. ניקוטין מגדיל את המספר הכולל של nAChRs התאסף בתוך תא, מגביר סחר כלפי הממברנה הפלזמה,ד משנה את ההרכבה של יחידות משנה להעדיף גרסת רגישות גבוהה של תת מסוימים. פתרון שינויים בולטים בסחר, הרכבה, וביטוי של קולטנים מודל המחלה מספק פרטים מכניסטית מכריע כי הם חיוניים כדי להגדיר מטרות תרופה. גישה אידיאלית תהיה להבדיל במהירות בין קולטנים תאיים ואלה מקומיים על קרום הפלזמה. זה מאתגר במיוחד במקרים בהם רוב של חלבון מסוים מתגורר intracellularly, כגון עם nAChRs. מאחר שרוב nAChRs הם נקודות אל reticulum endoplasmic, מדידות מסורתיות חסרות את הרזולוציה במרחב ובזמן דרושים כדי לאתר שינויי לוקליזציה וסחר לאורך מסלול ההפרשה. מחקרים סחר וביטוי קולטן של nAChRs נערכו בעיקר באמצעות radioligand מחייב 11, מבחני biotinylation 12, 13 סופג המערבי, או techniq immunoprecipitation UES 12. אלה תלויים הסגוליים המחייבים של מולקולת כתב או קיבעון של תאים חסרים את היכולת להבחין בו זמנית בין תושב הממברנה הפלזמה קולטנים תאי. לכן, מחקרים של דינמיקת שלפוחית הרכבת ערוץ היון הסתמכו בעיקר על טכניקות אלקטרו נמוכה תפוקת 14.
רזולוציה במרחב ובזמן Superior אפשרית עם התקדמות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גנטי מולקולות כתב מקודדות, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), על גרסותיה, תמנע בעיות מחייב ספציפיות ולהגדיל רגישות 15. גרסת pH רגישה של ה- GFP, המכונית pHluorin superecliptic (ספטמבר), שניתן להשתמש בם כדי לנצל הבדלי pH טמונים בין תאים בתוך תא לקבוע לוקליזציה 5, 7, 8,נ"צ "> 9, 16, 17, 18. ספטמבר מאיר כאשר pH גבוה מ -6, אך נשאר במצב כבוי ב- pH נמוך. לכן, קולטני מתוייגים עם ספטמבר בצד לומינל שלהם מזוהים כאשר נוכח reticulum endoplasmic ( ER) או על הכניסה לתוך קרום התא (PM), אבל לא כאשר מרותק שלפוחית סחר. מניפולציה של ה- pH תאיים במגע עם הקולטנים על קרום התא וכתוצאה מכך משנה את הקרינה ולכן זיהוי של קולטנים אלה. אם לאותו תא ברצף הוא צלם בשתי חומציות תאיים ניטראלית ואז pH נמוך מ -6, ההבדל בין התמונות מיוחסים קולטנים הממוקמים על קרום התא. הדבר זה מאפשר מדידה בו זמנית של תאיים (ER ההיקפי) ואת הקולטנים תושב קרום פלזמה 5, 7, 8 </sup>, 9. אירועי כניסת שלפוחית יחיד יכולים להיפתר גם כאשר pH התאי הוא ניטראלי. פעם שלפוחית סחר pH נמוכה נתיכים עם קרום הפלזמה, צד luminal של שלפוחית חשופת הפתרון הניטראלי התאי, גרימת מעבר זוהה כמו פרץ של קרינה 7, 18, 19, 20. ספטמבר מאפשר המדידה של קולטנים מקומיים על קרום פלזמת reticulum endoplasmic פריפריה, ומספק אמצעי למדידת סחר של קולטנים בין אזורי subcellular אלה 5, 7, 18.
כדי להשיג רזולוציה גבוהה יותר על הממברנה הפלזמה, קולטן עם ספטמבר מקודדים גנטי הוא צלם על ידי מיקרוסקופ בתפרחת ההשתקפות הפנימית המוחלט (TIRFM). שיטה זו היא במיוחדשימושי אם רוב הקולטנים הם נקודתיים לאזורים תאיים, מאז TIRFM מגדילה את הנראות של קרום הפלזמה. TIRFM גם מאפשר הרזולוציה של דינמיקת סחר של שלפוחית אחת נושאת קולטנים שכותרתו ספטמבר על להכניסו PM. השתקפות פנימית מוחלטת המתרחשת בבית הממשק של חומרים עם מדדי שבירה שונים, כגון בין תא לבין כיסוי החלקת זכוכית 21, 22. ספטמבר מאיר כאשר מוקרן עם עירור 488 ננומטר, אשר מכוון להשיג השתקפות פנימית מוחלטת על הממשק של פתרון זכוכית תא. זה יוצר גל חולף החודרת כ 150 ננומטר לתוך המדגם, fluorophores מרגש רק בתוך הכרך הזה. רק ספטמבר המכילים קולטני בסביבת pH ניטרלי בטווח זה של עירור מזוהים, המתאימים לאלה המתגוררים על קרום הפלזמה או reticulum endoplasmic הפריפריה. מאז גילוי מוגבל to עירור על ידי הגל החולף, קרינת רקע מהאזור התאי מצטמצם ואת יחס האות לרעש הוא גדל 21, 22. בנוסף, מאז קרינה אינו חודר את חלק הארי של התא, נזקי ממוזער המאפשר הדמיה תא חי במשך זמן. כתוצאה מכך, TIRFM בשילוב עם מקודד גנטית ספטמבר מספק את הרזולוציה והרגישות הגבוהה הנדרשת כדי למדוד הדינמיקה לוקליזציה וסחר subcellular של קולטני קרום לאורך מסלול הפרשה.
Protocol
Representative Results
Discussion
רגישות pH של ספטמבר מאפשרת קולטנים המתגוררים מופעל על הממברנה להיות נבדלים קולטנים תאי ב reticulum endoplasmic, וזה יכול לשמש כדי לפתור אירועי החדרת קולטן נושאת שלפוחית 5, 7, 8, 9, 18, <sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60x, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25×36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
Referências
- Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
- Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs. Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).
- Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer’s and Parkinson’s disease–a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
- Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
- Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
- Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
- Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
- Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
- Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
- Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
- Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
- Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I., Ming, L. . Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. 117, (2016).
- Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
- Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
- Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
- Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
- Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
- Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).
