Utilizzando Recettori pHluorin-tag per il monitoraggio subcellulare localizzazione e il traffico
Summary
Etichettare il dominio extracellulare di una proteina di membrana con un fluoroforo sensibile pH, superecliptic pHluorin (SEP), permette la localizzazione subcellulare, espressione, e il traffico da determinare. proteine Imaging SEP-etichettato con riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRFM) consente la quantificazione dei livelli di proteine nella membrana ER e nel plasma periferico.
Abstract
La comprensione traffico di membrana di proteine, il montaggio, e l'espressione richiede un approccio che distingue tra coloro che risiedono in organelli intracellulari e quelli localizzati sulla membrana plasmatica. misure tradizionali a base di fluorescenza non hanno la capacità di distinguere le proteine di membrana che risiedono in diversi organelli. Taglio metodologie all'avanguardia trascendono i metodi tradizionali di accoppiamento fluorofori pH-sensibile con microscopia a riflessione interna totale in fluorescenza (TIRFM). TIRF illuminazione eccita il campione fino a circa 150 nm dall'interfaccia di vetro-campione, riducendo così bassa, aumentando il rapporto segnale rumore e migliorando risoluzione. Il volume di eccitazione in TIRFM comprende la membrana plasmatica e organelli vicine, come il pronto soccorso periferico. Superecliptic pHluorin (SEP) è una versione sensibile pH di GFP. Geneticamente codifica settembre nel dominio extracellulare di una proteina di membrana di interesse posiziona il fluoroforo sulato luminale del ER e nella regione extracellulare della cella. SEP fluorescente quando il pH è superiore a 6, ma rimane in uno stato off a valori di pH inferiori. Pertanto, i recettori etichettati con settembre fluorescenza quando risiedono nel reticolo endoplasmatico (ER) o dopo l'inserimento nella membrana plasmatica (PM), ma non quando si trova ad una vescicola tratta o altri organelli, come il Golgi. Il pH extracellulare può essere regolata a dettare la fluorescenza dei recettori sulla membrana plasmatica. La differenza di fluorescenza tra le immagini TIRF a pH neutro e extracellulare acido per la stessa cella corrisponde a un numero relativo di recettori presenti sulla membrana plasmatica. Questo permette la misurazione simultanea di recettori intracellulari residenti e membrana plasmatica. eventi di inserimento vescicole singolo può anche essere misurato quando il pH extracellulare è neutro, corrispondente ad un basso vescicole traffico pH fusione con la membrana plasmatica e la transizione in uno stato fluorescente. Questo Versatile tecnica può essere sfruttata per studiare la localizzazione, espressione, e il traffico di proteine di membrana.
Introduction
Le variazioni di espressione dei recettori, la distribuzione, e l'assemblaggio sono stati collegati a una vasta gamma di malattie, tra cui il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, la fibrosi cistica, e la tossicodipendenza 1, 2, 3, 4, 5. Ad esempio, la nicotina e altri ligandi nicotinici influenzano il traffico di recettori nicotinici (nAChR) che portano a cambiamenti di traffico, di espressione, e upregulation 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10. La nicotina aumenta il numero totale di nAChR assemblate all'interno di una cella, aumenta il traffico verso la membrana plasmatica, und altera l'assemblaggio di subunità per favorire una versione ad alta sensibilità di alcuni sottotipi. Risolvere i cambiamenti distinti nel traffico, il montaggio, e l'espressione dei recettori in un modello di malattia fornisce dettagli cruciali meccanicistici che sono essenziali per definire bersagli farmacologici. Un approccio ideale sarebbe rapidamente distinguere tra recettori intracellulari e quelli localizzati sulla membrana plasmatica. Ciò è particolarmente impegnativo nei casi in cui una maggioranza di una particolare proteina intracellulare risiede, come ad esempio con nAChR. Dal momento che la maggior parte dei nAChR sono localizzate al reticolo endoplasmatico, le misure tradizionali non hanno la risoluzione spazio-temporale necessario per individuare la localizzazione e il traffico di modifiche lungo la via secretoria. Traffico di recettore e di espressione studi di nAChR sono stati principalmente condotti utilizzando radioligand vincolanti 11, saggi biotinylation 12, western blotting 13, o immunoprecipitazione techniq UES 12. Questi dipendono dalla specificità di legame di una molecola giornalista o fissazione di cellule e non hanno la capacità di distinguere tra simultaneamente residente membrana plasmatica e recettori intracellulari. Pertanto, gli studi di dinamica di montaggio canale ionico e vescicole hanno in gran parte affidamento su basso-throughput tecniche elettrofisiologiche 14.
risoluzione spaziale e temporale superiore è possibile con i progressi nella microscopia a fluorescenza. Molecole giornalista geneticamente codificate, come la proteina fluorescente verde (GFP) e le sue varianti, eliminare i problemi di legame non specifico e aumentano la sensibilità 15. Una variante sensibile pH di GFP, noto come superecliptic pHluorin (SEP), può essere utilizzata per sfruttare differenze di pH intrinseche tra compartimenti all'interno di una cella per determinare la localizzazione 5, 7, 8,ref "> 9, 16, 17, 18. settembre fluorescente quando il pH è superiore a 6, ma rimane in uno stato off a pH inferiore. Pertanto, i recettori contrassegnate con SEP loro lato luminale vengono rilevati quando presente nel reticolo endoplasmatico ( ER) o dopo l'inserimento nella membrana plasmatica (PM), ma non quando confinato in una vescicola traffico. manipolazione del pH extracellulare in contatto con recettori sulla membrana plasmatica altera conseguentemente la fluorescenza e quindi il rilevamento di questi recettori. Se la stessa cella viene sequenzialmente ripreso sia a pH extracellulare neutro e poi un pH inferiore a 6, la differenza tra le immagini è attribuita a recettori situati sulla membrana plasmatica. Questo consente la misurazione simultanea di intracellulare (ER periferica) e recettori membrana plasmatica residenti 5, 7, 8 </sup>, 9. eventi di inserimento vescicole singolo possono essere risolti quando il pH extracellulare è neutrale. Una volta che un basso vescicole traffico pH fonde con la membrana plasmatica, lato luminale della vescicola è esposta alla soluzione extracellulare neutra, causando una transizione rilevata come una raffica di fluorescenza 7, 18, 19, 20. Settembre permette di misurare recettori localizzati alla membrana plasmatica e periferico reticolo endoplasmatico, e fornisce un mezzo per misurare il traffico di recettori tra queste regioni subcellulari 5, 7, 18.
Per ottenere una risoluzione più alta a livello della membrana plasmatica, un recettore con la SEP geneticamente codificato viene ripreso al microscopio a riflessione interna totale fioritura (TIRFM). Questo metodo è particolarmenteutile se la maggior parte dei recettori sono localizzati a regioni intracellulari, poiché TIRFM aumenta la visibilità della membrana plasmatica. TIRFM consente anche la risoluzione della dinamica di traffico dei singoli vescicole che trasportano i recettori SEP-etichettati su inserimento nel PM. Riflessione totale avviene all'interfaccia tra materiali con differenti indici di rifrazione, come tra una cella e un vetro di copertura antiscivolo 21, 22. Settembre fluorescente quando irradiato con 488 nm di eccitazione, che è orientata per ottenere la riflessione interna totale all'interfaccia della soluzione vetro e cellule. Questo produce un'onda evanescente che penetra circa 150 nm nel campione, solo fluorofori emozionanti all'interno di questo volume. Solo Settembre contenente recettori in un ambiente pH neutro in questo intervallo di eccitazione vengono rilevati, corrispondenti a quelli residenti sulla membrana plasmatica o periferica reticolo endoplasmatico. Dal momento che il rilevamento è limitata to di eccitazione dal onda evanescente, fluorescenza di fondo della regione intracellulare è ridotto e il rapporto segnale-rumore viene aumentato 21, 22. Inoltre, poiché la radiazione non penetra la massa della cella, photodamage è minimizzato che permette l'imaging cellulare dal vivo nel corso del tempo. Come risultato, TIRFM accoppiato con geneticamente codificato settembre fornisce l'alta risoluzione e la sensibilità richiesta per misurare subcellulari localizzazione e traffico dinamiche di recettori di membrana lungo la via secretoria.
Protocol
Representative Results
Discussion
La sensibilità pH SEP consente recettori residenti sulla membrana plasmatica di distinguerli dai recettori intracellulari nel reticolo endoplasmatico, e può essere utilizzato per risolvere gli eventi di inserimento del recettore porta-vescicole 5, 7, 8, 9, 18, 19, 20 . Diverse tecniche tr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the National Institute on Drug Abuse T32 DA 016176, National Institute on Drug Abuse DA 038817, and National Institute on Drug Abuse DA 040047.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2 | VWR | 82050-856 | |
| 35 mm glass bottom petri dishes, sterile | Cell E&G | GBD00002-200 | |
| Poly-D-lysine | vwr | 215017510 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Fisher Scientific | 11-965-084 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco / Fisher Scientific | 31-985-088 | |
| Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered) | Gibco / Fisher Scientific | 16-000-044 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red | Fisher Scientific | 12604-021 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | VWR | 45000-652 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco / Fisher Scientific | 21083027 | Optional |
| Lipofectamine | Fisher Scientific | 11668030 | Gently mix; Do not vortex |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-10 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Objective immersion oil | Olympus | Type F | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Camera | Andor | iXon Ultra 897 | |
| 60x, 1.49 NA oil immersion objective | Olympus | APON 60XOTIRF | |
| Motorized stage | Prior | IXPROXY | |
| Motorized actuator (stepper motor) | Thorlabs | ZST213 | |
| MetaMorph (or other imaging program) | Metamorph | ||
| 488 nm laser | Market Tech | ||
| Single mode fiber | Thorlabs | SM450 | |
| Mirrors | Thorlabs | BB1-E01 | |
| Dichroic 488 nm LP | Semrock | Di02-R488-25×36 | |
| Bandpass filter, 488 nm | Semrock | LL01-488-12.5 | |
| Bandpass filter, 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 |
Referências
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