כתב יד זה משתמש VirusMapper חבילת תוכנות הקוד הפתוח המבוססת פיג'י ליישם ניתוח חד חלקיקים לתמונות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה כדי ליצור מודלים מדויקים של מבנה הננומטרי.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי סופר-רזולוציה היא מהפכה כרגע מחקר בביולוגיה של התא. יכולתה לשבור את מגבלת הרזולוציה של סביב 300 ננומטר המאפשרת הדמיה השגרתית של מתחמים ביולוגיים ננו ותהליכים. עלייה זו החלטה גם אומרת כי שיטות פופולריות במיקרוסקופ אלקטרונים, כגון ניתוח חד חלקיקים, יכולות בקלות להיות מיושמות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סופר-רזולוציה. על ידי שילוב של גישה האנליטית זה עם הדמיה אופטית ברזולוציה סופר, ניתן יהיה לנצל את קיבולת תיוג ספציפית-מולקולה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי ליצור מפות מבניות של אלמנטים מולקולריים בתוך מבנה metastable. לשם כך, פיתחנו אלגוריתם רומן – VirusMapper – ארוז כמו קל לשימוש, בעל ביצועים גבוהים, ו-תפוקה גבוהה תוסף ImageJ. מאמר זה מציג מדריך מפורט לתוכנה זו, מציגה את יכולתה לחשוף תכונות מבניות רומן מ ביולוגימתחמי olecular. כאן, אנו מציגים כיצד להרכיב נתונים תואמים ולספק צעד-אחר-צעד פרוטוקול על אופן השימוש באלגוריתם זה כדי להחיל ניתוח חד חלקיקי תמונות ברזולוציה סופר.
מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה (SR) היה השפעה גדולה על ביולוגיה של תא על ידי מתן יכולת תהליכים מולקולריים מפתח תמונה יחד עם התיוג המולקולרי הספציפי מכריע להבנה אותם. SR מאפשר כעת מיקרוסקופ אור להתקרב החלטות (20-150 ננומטר) בעבר רק השגה עם מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) תוך שמירה על היתרונות הגדולים של מיקרוסקופ אור, כגון פוטנציאל תמונה חיה תאים 1, 2. יתר על כן, שימור המבנים גילו ברמת ננו מאפשר היישום של ניתוח חד חלקיקים (SPA) לנתוני SR, קונספט שימוש נרחב במיקרוסקופ אלקטרונים 3. שימוש SPA, רבים מאוד עותקים שמורים של מבנה יכול להיות צילמו בממוצע יחד כדי לשפר את הרזולוציה, דיוק, או אות-לרעש הפנימיים והחיצוניים. כאשר משתמשים בשילוב עם SR, SPA הודגמה להיות כלי רב עוצמה עבור-p גבוההמיפוי recision של רכיבים של המתחם הנקבובי גרעין 4, 5, 6 centrosomes, וירוסים, כגון HIV 7 ו HSV-1 8.
עם זאת, היישום המשולב השיגרתי של SR ו SPA אותגר על ידי חוסר תוכנה זמינה. מסיבה זו, פתחנו VirusMapper, תוסף לתוכנת עיבוד תמונה הפופולרית 9 ImageJ / פיג'י. זוהי חבילת התוכנה הראשונה בחופשיות הזמינה עבור SPA כללית עם תמונות קרינת 10 נועדו לספק מהיר, ידידותי למשתמש, רב ערוצית מיצוע נאיבי של מבנים צלמו עם מיקרוסקופ SR. למרות מיועד וירוסים, זה יכול להיות מיושם על כל מורכבות מולקולארית אשר מינים מולקולריים שונים ניתן הדמיה, מזוהים מקומית.
VirusMapper יכול לשמש כדי לייצר דיוק גבוה מולקולרימודלים של כל מבנה ידוע, המאפשרים החישוב של ממדים ממוצעים ופרמטרים נוספים. עיצוב האלגוריתם עושה את זה שימושי במיוחד עבור הפרדת אוכלוסיות של מבנים, מתן לקביעת נטיות נפרדות או מדינות מורפולוגיים שונות. בנוסף, הדמית רב ערוצית יכול לשמש כדי להעסיק ערוץ התייחסות במקרים בם המבנה הבסיסי הוא ידוע, ובכך לאפשר גילוי מבנה מבוסס הפניה. בהוראות להורדה והתקנה של התוכנה ניתנות על https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper . נתוני דוגמא ניתן למצוא גם שם, ומשתמשים מומלצים לתרגל באמצעות התוכנה על נתונים לדוגמה לפני שתנסה ליישם אותו לשלהם.
הנה, את השלבים באמצעות התוסף הזה כדי לייצר מודלים SPA מנתונים גולמיים מתוארים. התוכנה לוקחת תמונות גולמיות המכילות o חדr מבנים רבים-שכותרתו כקלט. זה חוזר, בכפוף למספר הפרמטרים מותאמים כתוכנה מנוהלת, מודלי SPA מראים ההפצות הממוצעות של הרכיבים שכותרתו בתוך המבנים צלמו.
מטרת פרוטוקול זה היא לייצר מודלי SPA מדויקים מתן localizations הממוצע של רכיבים בתוך מבנים צלמו פי בצנרת המתוארת באיור 1. כפי שניתן לראות בתרשים 1, זרימת עבודת התוכנה מחולקת מועילה לשלושה שלבים. השלב הראשון הוא תמונות גדולות פלח, וכתוצאה מכך ערימות של חלקיקים עבור כל ערוץ. חלקיקים אלה הם היחידות שיוקצה בממוצע כדי ליצור מודלים לייצר זרעים עבור דור מודל. השלב השני הוא ליצור תמונות זרע, אשר משמשות כדי לרשום את הסט כולו של חלקיקים בשלב הסופי. הדבר נעשה על ידי בחירת ערוץ התייחסות ובחירת חלקיקים ידנית בערוץ זה כי יתרום היםeeds. זרעים נבחרים בערוץ האזכור הזה אבל יכול להיות שנוצר עבור כל הערוצים. חלקיקים בתחילה הם העמידו על ידי התאמת גאוס 2D באפיק זה. כל החלקיקים אשר נבחרו וכיוונו את עצמם מחדש הם מיצוע לייצר זרע. עבור כל מבנה נפוץ לראות את הנתונים הם להיות מודל, יש לבחור חלקיקים כמו זרעים בצורה ברורה ומדויק מייצגים מבנה. הממשק בשלב זה שימושי גם עבור סריקת נתונים עבור מבנים כאלה.
השלב האחרון הוא ליצור מודלים באמצעות התאמת תבנית. זו מושגת באמצעות הרישום של חלקיקי חילוץ במקור על תמונות הזרע שנוצרו בסעיף הקודם על ידי מתאמים צולבים. תת-קבוצה קטנה של חלקיקים הרשום בממוצע יחד, והתהליך חוזר על עצמו עוד יותר כדי להפחית מודל טעות ריבועית ממוצעת, אם ירצה בכך. משנה זו נקבעת על פי הגדרת דמיון מזערי כנגד הזרע כי חייב להיות מרוצה. בעת יצירת מודלזה בו זמנית מספר רב של ערוצים, הדמיון המשותף, או לממוצע של הדמיון עבור כל ערוץ, משמש. מודלי כתוצאה ואת החלקיקים הרשומים שתרמו אותם לאחר מכן ניתן לנתח נוסף.
בעזרת שיטה זו, חוקרים מצוידים לשלב את העוצמה של SPA מיקרוסקופית SR כדי ליצור מודלים 2D דיוק גבוהה, רב ערוצית של אדריכלות חלבון של וירוסים מתחמי macromolecular אחרים. עם זאת, כמה שיקולים חשובים צריכים להילקח בחשבון.
זרעים יש לבחור לייצג מבנה נתפס באופן עקבי. לפיכך, הנתונים הגולמיים יש לבדוק היטב לפני הזרעים נבחרים. זה חשוב למניעת דגמים משוחדים. בחירות יכולות להיות מאומתות על ידי בחינת סף הדמיון המינימאלי הדרוש כדי לכלול מספר מסוים של חלקיקי הדגמים. ברור, עבור בחירה של הזרע, כך עולה סף זה צריך להיות עבור מספר נתון של חלקיקים, מבנה יותר כי הוא לכאורה בנתונים.
הקונספט התאמת התבנית הוא שימושי במיוחד כאשר ישנה הטרוגניות בנתונים. כל המבנים השונים כי הם visible יש לזהות מודלים שונים שנוצרו עבור כל מקרה. על ידי הפרדת מבנים הטרוגנית בערוץ אחד אבל בו זמנית יוצרים מודלים בערוץ שני, דפוסים יכולים לצוץ לא היה ברור מייד.
שיקול נוסף כדי להיות מודע כאשר באמצעות אלגוריתם זה הוא כי ההליך איטרציה יהיה למקסם אסימטריה סטוכסטיים. לדוגמא, בעת בניית המודל של מבנה עם שתי מקסימה סימטרית, כל הסימטריות הקלות בין המקסימום תהיינה מיושרות עם השני במהלך איטרציה, ואת המודל הסופי ובכך יהיה אסימטרי מקסימאלי. אם זה אינו משקף סימטריה ידועה במבנה להיות מודל, אז זה צריך להילקח בחשבון. נכון לעכשיו, הדרך היחידה למנוע מיצוי זו היא להגביל את מספר החזרות כדי 1, למרות התפתחות פוטנציאל תהיה עבור VirusMapper לשלב צירה הסימטריה לתוך תהליך יצירת מודל. כל גרסאות חדשות של VirusMapper יהיו available באתר ההפניה (ראה טבלת חומרים). משתמשים יוכלו למצוא שאלות נפוצות כאן כדי לענות על כל שאלות נפוצות.
התוכנה כמתוארת ישימה לכל מבנה שיכול להיות צלם עם רזולוציה מספיקה כדי להמחיש את התכונות שהמשתמש מבקש לבנות מודל. למרות SPA יכול לשפר את הרזולוציה, זה בבירור לא ישפר את הנראות של תכונות שאינן אחר לא גלויים. פרוטוקול זה אינו, אפוא, שיטה לשיפור איכות הנתונים. כמו בכל טכניקה, הכנת מדגם זהירה ואופטימיזציה של אסטרטגיית הדמיה תספק את הנתונים הנקיים דגמי כתוצאה הטובים.
הבחירה של שיטת הדמיה SR הוא גם חשוב, בכלל, יהיה תלוי מדגם בהישג יד. VirusMapper אומת לעבוד היטב עם ה- SIM STED 10, וזה גם יכול לשמש עם נתונים מיקרוסקופיה לוקליזציה באיכות גבוהה, אך יש להיזהר במקרה הזה,כמו תיוג דליל יכול לגרום לבעיות דומות לאלו של מקסום סימטריה.
נכון לעכשיו, VirusMapper הוא האלגוריתם רק בחופשיות הזמינה עבור הניתוח חד חלקיקים של תמונות קרינה ואת תוכנת 2D SPA מיצוע למטרות כלליות בלבד. מחקרים אחרים שהפכו שימוש באותם העקרונות 4, 6, 8 השתמשו בתוכנה מותאמת אישית מתמחה לכל מחקר מסוים. אלגוריתמים תכליתיים כללית לשיקום נתוני 3D פורסמו 5, 18, למרות שאף תוכנה סופקת.
כאשר נעשה שימוש כמתואר במאמר זה, VirusMapper יכול לשמש כדי לייצר מודלים מדויקים, מדויקים, וכן חזקים של אדריכלות החלבון מולקולארית של וירוסי מתחמי אחרים. עם מודלים אלה, חוקרים יכולים לבצע מדידות מדויקות של הממדים הממוצעים של structures תחת מחקר, באופן פוטנציאלי לאפשר להם להגיע למסקנות ביולוגיות כי לא היו אפשרית אחרת.
יתר על כן, עם היכולות הרבות ערוצית של טכניקה זו, אפשר למפות מספר בלתי מוגבל של חלבונים ורכיבים בתוך מתחמים ולגלות ארגון חלבון רומן. בחינת שינויים במבנה ננומטרי בתנאים שונים הרלוונטיים ביולוגית, כגון בשלבים שונים של מחזור החיים של הנגיף, יש את הפוטנציאל להציע תובנות רבות ערך בביולוגיה.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות קורינה Beerli, יז'י Samolej, פדרו מטוס פרירה, כריסטופר בלק, ואת קתרין שרר על תרומתם לפיתוח ואימות המקורי של VirusMapper. אנחנו גם רוצים להודות ארתור Yakimovich לקריאה הביקורתית שלו של כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי תרומות של ביוטכנולוגיה ו מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BB / M022374 / 1) (RH); מימון הליבה אל מעבדה MRC עבור לביולוגיה מולקולרית של התא, ביוניברסיטי קולג 'בלונדון (JM); המועצה האירופית למחקר (649,101-UbiProPox) (JM); ואת המועצה למחקר רפואי (MR / K015826 / 1) (RH ו- JM). RG ממומנת על ידי המועצה למחקר הנדסה המדעים הפיזיקליים (EP / M506448 / 1).
Fiji | Open-source image analysis software | ||
NanoJ-VirusMapper | developed by the Henriques lab | Open source-Fiji plugin (https://bitbucket.org/rhenriqueslab/nanoj-virusmapper) | |
VectaShield antifade mounting medium | Vector Labs | H-100 | |
Elyra PS1 | Zeiss | ||
ZEN BLACK | Zeiss | Image processing software for SIM | |
High performance coverslip | Zeiss | 474030-9000-000 | |
TetraSpeck beads | ThermoFisher | T7279 |