En helmontert immunohistokemisk tilnærming, for å visualisere nevrofilamentproteinuttrykk i den ekstrahepatiske galdevegen i Suncus murinus. Presenteres her. Denne protokollen kan brukes til å analysere innerveringen av alle viskoser i S. murinus eller andre arter.
Dette arbeidet beskriver den fullstendige immunhistokjemiske fargemetoden i detalj, ved bruk av nevrofilament-antistoff til å merke innerveringen av galdevegen i Suncus murinus ( S. murinus ). Først ble prøven dissekert fra S. murinus og fiksert i 4% paraformaldehyd (PFA). For det andre ble en enzymatisk behandling og potensiell endogen peroksidaseinaktivering utført. Prøven ble deretter utsatt for det primære antistoff, anti-nevrofilamentproteinantistoff i 3-6 dager. Den ble deretter inkubert med det sekundære antistoffet konjugert med pepperrotperoksidase. Fargereaksjonen ble avslørt ved å reagere prøven med et 3,3'-diaminobenzidin (DAB) substrat. Denne metoden kan brukes for å analysere innervaringen av alle organer. Videre kan denne protokollen også tilpasses for å teste andre neuronale antistoffer, men optimalisering av antibodiesDet bør gjøres først. Denne metoden ble opprinnelig innført av Kuratani og Tanaka 1 , 2 , 3 .
Huset muskeskrue , Suncus murinus , tilhører ordren Insectivora og familien Soricidae. Dette lille pattedyret er fordelt over hele Sørøst-Asia og beboer hus og grøntområder som ligger i nærheten av menneskelige beboer eller storfepenner 4 . Denne arten viser generelle morfologiske egenskaper mer lik mennesker enn andre laboratoriedyr, som mus, rotte og kanin 5 . Tidligere ble helmontert immunfarging med en perifer neuronmarkør for S. murinus nevrofilamentprotein (NFP) brukt til å merke perifere nerver i bukspyttkjertelen 6 , major duodenal papilla 7 , pylorus 8 , galleblæren 5 og ekstrahepatisk biliary 9 .
NFP er et makromolekylært kompleks som er en del av det modne neuronale cytoskeletet. Neurofilament-relatert proteinS formidler interaksjoner mellom NFP og zygosomet. Både enzymfunksjonen og strukturen av linkerproteiner reguleres av NFP 10 . NFP-komplekset er laget av tre polypeptider: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) og NF-H (200 kDa). NFP kan bli funnet i neuronal axon i både sentrale og perifere nervesystemet. Anti-humant NFP antistoff har vist seg å markere aksoner i sentral- og perifert nervesystem. Anatomiske og elektrofysiologiske undersøkelser har vist at sphincter, galleblæren og proksimal gastrointestinalt kanal er forbundet 11 , 12 , 13 , 14 . Imidlertid er de morfologiske egenskapene til deres nevronforbindelser ennå ikke definert.
Dette arbeidet demonstrerer bruk av en helmontert immunhistokemisk fargemetode for å merke innerveringen av S. murinus bilIary-kanalen med et NFP-antistoff.
Dette arbeidet beskriver den eksperimentelle prosedyren for visualisering av innerveringen av den ekstrahepatiske gallveien ved bruk av et antistoff mot nevrofilamentprotein. Denne protokollen ble tilpasset fra protokollen beskrevet av Kuratani og Tanaka 1 , 2 , 3 .
For dette eksperimentet planlegger du tidslinjen for hvert av forsøkene, ettersom den fullstendige fargingsmetoden fortsetter i 2-3 uk…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen bekreftelser.
orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
papain | Wako | 164-00172 | |
bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
imidazole | Sigma | I-0125 |