Usando um método imunohistoquímico de montagem total para estudar a preservação do trato biliar em<em> Suncus murinus</em
Summary
Uma abordagem imuno-histoquímica de montagem total, para visualizar a expressão da proteína de neurofilamento no trato biliar extra-hepático em Suncus murinus. É apresentado aqui. Este protocolo pode ser usado para analisar a inervação de todos os órgãos viscerais em S. murinus ou outras espécies.
Abstract
Este trabalho descreve detalhadamente o método de coloração de imuno-histoquímica total, usando anticorpo de proteína de neurofilamento para rotular a inervação do trato biliar em Suncus murinus ( S. murinus ). Primeiro, a amostra foi dissecada de S. murinus e fixada em paraformaldeído a 4% (PFA). Em segundo lugar, foram realizados um tratamento enzimático e potencial inativação da peroxidase endógena. O espécime foi então exposto ao anticorpo primário, anticorpo anti-proteína de neurofilamento, durante 3-6 dias. Foi então incubado com o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano. A reação de cor foi revelada fazendo reagir o espécime com um substrato de 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Este método pode ser aplicado para analisar a inervação de todos os órgãos viscerais. Além disso, este protocolo também pode ser adaptado para testar outros anticorpos neuronais, mas a otimização do antibodiO primeiro deve ser feito primeiro. Este método foi originalmente introduzido por Kuratani e Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
A muscaria Musk Muscus , Suncus murinus , pertence à ordem Insectivora e Soricidae familiar. Este pequeno mamífero é distribuído em todo o Sudeste Asiático e habita casas e áreas gramadas que se situam perto de habitações humanas ou canetas de gado 4 . Esta espécie exibe características morfológicas gerais mais semelhantes aos humanos do que outros animais de laboratório, como o mouse, o rato e o coelho 5 . Anteriormente, foi utilizada imunomarquência total com um marcador de neurônio periférico para a proteína de neurofilamento de S. murinus (NFP) para rotular os nervos periféricos no pâncreas 6 , a papila duodenal principal 7 , o píloro 8 , a vesícula biliar 5 e o trato biliar extra-hepático 9 .
NFP é um complexo macromolecular que faz parte do citoesqueleto neuronal maduro. Proteína relacionada ao neurofilamentoMede as interações entre NFP e o zygosoma. Tanto a função enzimática quanto a estrutura das proteínas de ligação são reguladas pelo NFP 10 . O complexo NFP é composto de três polipéptidos: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) e NF-H (200 kDa). O NFP pode ser encontrado em axônios neuronais no sistema nervoso central e periférico. O anticorpo anti-NFP humano mostrou rotular os axônios do sistema nervoso central e periférico. Investigações anatômicas e eletrofisiológicas demonstraram que o esfíncter, a vesícula biliar e o trato gastrointestinal proximal estão conectados 11 , 12 , 13 , 14 . No entanto, as características morfológicas de suas conexões neuronais ainda não foram definidas.
Este trabalho demonstra o uso de um método de coloração imuno-histoquimica de todo o suporte para rotular a inervação do S. murinus bilCom um anticorpo NFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho descreve o procedimento experimental para a visualização da inervação do trato biliar extra-hepático usando um anticorpo contra a proteína do neurofilamento. Este protocolo foi adaptado do protocolo descrito por Kuratani e Tanaka 1 , 2 , 3 .
Para esta experiência, planeje a linha de tempo para cada uma das experiências, já que a abordagem de coloração total continua por 2-3 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores não têm reconhecimento.
Materials
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
Referências
- Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung. Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).
- Kuratani, S., Tanaka, S. Peripheral development of avian trigeminal nerves. Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).
- Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy. World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).
- Yi, S. Q., et al. Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation. Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures. Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).
- Yi, S. Q., et al. Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy. World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).
- Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study. Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).
- Wang, H., et al. Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases. Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).
- Wyatt, A. P. The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder. J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).
- Mawe, G. M., Kennedy, A. L. Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig. Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).
- Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster. Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).
- Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum. Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography. J. Vis. Exp. (62), e4042 (2012).
