Uso de un método inmunohistoquímico de montaje completo para estudiar la inervación del tracto biliar en<em> Suncus murinus</em
Summary
Un enfoque inmunohistoquímico de montaje completo, para visualizar la expresión de la proteína neurofilamento en el tracto biliar extrahepático en Suncus murinus. Se presenta aquí. Este protocolo se puede utilizar para analizar la inervación de todos los órganos viscerales en S. murinus u otras especies.
Abstract
Este trabajo describe el método de tinción inmunohistoquímica de montaje completo en detalle, usando anticuerpos de proteína de neurofilamento para marcar la inervación del tracto biliar en Suncus murinus ( S. murinus ). En primer lugar, se disecó el espécimen de S. murinus y se fijó en paraformaldehído al 4% (PFA). En segundo lugar, se realizó un tratamiento enzimático y la inactivación potencial de la peroxidasa endógena. La muestra se expuso entonces al anticuerpo primario, anticuerpo de proteína anti-neurofilamento, durante 3-6 días. A continuación se incubó con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. La reacción de color se reveló haciendo reaccionar la muestra con un sustrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Este método se puede aplicar para analizar la inervación de todos los órganos viscerales. Además, este protocolo también puede adaptarse para probar otros anticuerpos neuronales, pero la optimización de los anticuerposDebe hacerse primero. Este método fue introducido originalmente por Kuratani y Tanaka 1 , 2 , 3 .
Introduction
La musaraña almizcle, Suncus murinus , pertenece a la orden Insectivora y la familia Soricidae. Este diminuto mamífero se distribuye por todo el sudeste asiático y habita en casas y zonas de césped situadas cerca de viviendas humanas o corrales de ganado 4 . Esta especie presenta características morfológicas generales más similares a las humanas que otros animales de laboratorio, como el ratón, la rata y el conejo 5 . Anteriormente, se utilizó inmunotinción de montaje completo con un marcador de neurona periférica para la proteína del neurofilamento de S. murinus (NFP) para marcar los nervios periféricos en el páncreas 6 , la papila duodenal principal 7 , el píloro 8 , la vesícula biliar 5 y el tracto biliar extrahepático 9 .
NFP es un complejo macromolecular que forma parte del citoesqueleto neuronal maduro. Proteína relacionada con los neurofilamentosS median las interacciones entre NFP y el zygosome. Tanto la función enzimática como la estructura de las proteínas de unión están reguladas por el NFP 10 . El complejo NFP está compuesto por tres polipéptidos: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) y NF-H (200 kDa). NFP se puede encontrar en axones neuronales en el sistema nervioso central y periférico. Se ha demostrado que el anticuerpo anti-NFP humano marca los axones del sistema nervioso central y periférico. Las investigaciones anatómicas y electrofisiológicas han demostrado que el esfínter, la vesícula biliar y el tracto gastrointestinal proximal están conectados 11 , 12 , 13 , 14 . Sin embargo, las características morfológicas de sus conexiones neuronales aún no se han definido.
Este trabajo demuestra el uso de un método de tinción inmunohistoquímica de montaje completo para etiquetar la inervación de S. murinus bilCon un anticuerpo NFP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo describe el procedimiento experimental para la visualización de la inervación del tracto biliar extrahepático utilizando un anticuerpo contra la proteína neurofilamento. Este protocolo fue adaptado a partir del protocolo descrito por Kuratani y Tanaka 1 , 2 , 3 .
Para este experimento, planifique la línea de tiempo para cada uno de los experimentos, ya que el enfoque de tinción de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen reconocimientos.
Materials
| orthoperiodic acid | Wako | 162-00732 | |
| papain | Wako | 164-00172 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Wako | 010-15131 | |
| sodium azide | Nacalai Tesque | 312-33 | |
| neurofilament protein (NFP) antibody | Dako | M0762, lot 089, clone: 2F11 | |
| peroxidase-conjugated affinity-purified sheep anti-mouse IgG-HRP | MBL | Code 330 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) | Wako | 349-00903 | |
| imidazole | Sigma | I-0125 |
Referências
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